能力验证中霉菌和酵母计数影响因素探讨

陈秀芬 梁展翘 周 露

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

霉菌和酵母计数主要用于判定样品被真菌污染的程度和检测样品中真菌的性质和繁殖动态，是食品安全国家标准系列常规检测项目之一，也是评价食品质量的重要卫生指标之一。 绝大多数霉菌和酵母不会对人体直接造成危害，少部分可导致食品腐败变质或产生真菌毒素，影响人体健康，主要表现为慢性中毒、致癌、致畸、致突变作用[1]。 并且霉菌和酵母的细胞较大，代谢能力比细菌强，标准限量更为严格。

目前，国内外霉菌和酵母计数的方法主要有平板计数法、显色培养基计数法、WKJ-Ⅱ型微生物快速检测系统、流式细胞仪计数法和测试纸片法[2]，每种方法均有其优点和局限性。GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数采用平板计数法》[3]检测过程虽简单易操作，但存在培养时间长、霉菌蔓延影响计数和孢子污染等缺点。 并且不同霉菌酵母对环境温湿度及营养成分的要求也会有所不同，所以要在同等条件下培养出所有的霉菌酵母，准确、快速反映出样品的真实情况，是食品卫生部门面临的一个重要问题[4]。

能力验证利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力，是一种重要的外部质量评价活动[5]。 通过参加能力验证，可以客观考核实验室能力和管理状况，保证实验室资质认定的有效性和持续监控实验室的运行状态，确保检验检测活动的质量[6]。 为了提高实验室霉菌和酵母的检测能力，开展实验室检测能力的自我监控，广东省食品检验所实验室于2019 年10 月参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心申请亚太经济合作组织（APEC）自筹项目SCSC 03 2019S《食品微生物检测能力验证》，比对结果满意。通过本次能力验证，确定了广东省食品检验所实验室霉菌和酵母计数的检测水平，进一步监控了实验室人员的持续检测能力。

2 材料与仪器

2.1 材料与试剂

能力验证样品：本次研究中所采用的能力验证样品均由中国检验检疫科学研究院测试评价中心申请APEC 自筹项目SCSC 03 2019S《食品微生物检测能力验证》提供，样品编号为19E-381 和19F-979。

试剂：孟加拉红琼脂（广东省环凯微生物有限公司、北京陆桥技术股份有限公司，以下简称环凯和陆桥）；马铃薯葡萄糖琼脂（环凯、陆桥）；无菌蒸馏水。

2.2 仪器与设备

SX-700 型高压灭菌器（日本 TOMY 公司）；SWCJ-2F 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；LRH-250 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

3 试验方法

3.1 样品处理

将样品从冰箱内取出恢复至室温。 根据作业指导书，样品需要采用40 mL 无菌蒸馏水复原。 开启后立即加入4 mL 无菌蒸馏水进行复原，待充分溶解后，吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的蒸馏水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中。此溶液即为待测样品原液，充分振摇后采用无菌操作稀释至10-5。同时分别吸取1 mL 无菌蒸馏水加入2 个无菌平皿作为空白对照。

3.2 孟加拉红培养基倾注法

选择原液和10-1～10-5样品匀液，每个稀释度吸取 1 mL 匀液于 2 个无菌平皿中，及时将 20～25 mL 冷却至46℃的孟加拉红琼脂倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 待琼脂凝固后，正置平板，置于28℃培养箱中培养，观察并记录培养至第5 d 的结果。

3.3 马铃薯葡萄糖倾注法

选择原液和10-1～10-5样品匀液，每个稀释度吸取 1 mL 匀液于 2 个无菌平皿中，及时将 20～25 mL 冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 待琼脂凝固后，正置平板，置于28℃培养箱中培养，观察并记录培养至第5 d 的结果。

4 结果与分析

4.1 霉菌和酵母在不同培养基上的形态特征

孟加拉红琼脂中含有孟加拉红成分，又名虎红，化学名为四碘四氯荧光素钠盐或钾盐，主要是作为选择性抑菌剂、抑制细菌生长，且减缓霉菌菌落因生长过快导致的蔓延生长，使其更加致密。霉菌菌落有明显菌丝，背面中心呈深粉红色、四周呈浅粉色，易于计数。 酵母菌落较小，呈粉红色，表面光滑、湿润、粘稠，便于观察计数。 其中，陆桥牌和环凯牌孟加拉红琼脂中霉菌和酵母形态特征均较为明显，易于区分和计数，详见图1。

图1 霉菌和酵母在不同牌子的孟加拉红琼脂上的形态特征

马铃薯葡萄糖琼脂中生长的霉菌菌落有明显菌丝，呈浅黄色到深黄色，容易蔓延生长，边缘不清晰、不易于识别。而酵母菌落较小，呈浅黄色，表面光滑、湿润、黏稠，检出率较低，且易被霉菌遮蔽，都不便于观察计数。其中，陆桥牌孟加拉红琼脂中霉菌和酵母比环凯牌孟加拉红琼脂显色明显、边缘清晰，更易于区分和计数，详见图2。

在现实检测中，存在霉菌和酵母用肉眼无法区分的情况，可在低倍显微镜下观察，霉菌有明显菌丝体呈发散状，酵母边缘较细腻规整、周围有卵圆形孢子，详见图3。

根据陈红平[7]等人的研究，在显微镜下，酵母菌活细胞为无色，死细胞为蓝；直接镜检时，霉菌丝壁如同两条平行的线，这是区别霉菌菌丝和其他纤维最有用的特征，此外菌丝较长、多呈分枝状，是鉴定霉菌最可靠的特征之一。

图2 霉菌和酵母在不同牌子的孟加拉红琼脂上的形态特征

图3 霉菌和酵母在低倍显微镜下的形态特征

4.2 霉菌生长计数

采用不同生产厂家的孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂倾注、培养后，样品19E-381 和19F-979霉菌计数结果详见表1 和表2。 对于样品19E-381，在孟加拉红琼脂中，环凯产品霉菌数量比陆桥产品低16.1%（相对标准偏差RSD=12.4%），在马铃薯葡萄糖琼脂中，环凯产品霉菌数量比陆桥产品高4.8%（RSD=6.7%）；对于样品19F-979，在孟加拉红琼脂中，环凯产品霉菌数量比陆桥产品低19.2%（RSD=10.6%），在马铃薯葡萄糖琼脂中，环凯产品霉菌数量比陆桥产品高 10.0%（RSD=6.7%）。19E-381 和 19F-979 的不同培养基的霉菌计数结果详见表1。

4.3 酵母生长计数

采用不同生产厂家的孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂倾注、培养后，样品19E-381 和19F-979 酵母计数结果详见表1 和表2。 对于样品19E-381，在孟加拉红琼脂中，环凯产品酵母数量比陆桥产品低13.6%（RSD=10.3%），在马铃薯葡萄糖琼脂中，环凯产品酵母数量比陆桥产品低10.0%（RSD=7.4%）；对于样品19F-979，在孟加拉红琼脂中，环凯产品酵母数量比陆桥产品低31.3%（RSD=26.2），在马铃薯葡萄糖琼脂中，环凯产品酵母数量比陆桥产品低13.6%（RSD=10.3%）。 19E-381 和 19F-979 的不同培养基的酵母计数结果见表2。

4.4 能力验证结果和统计结果评价

参加本次能力验证的84 个实验室中，2 个测试结果均为满意的实验室有65 个，满意率为77.4%。实验室间比对Z 值分布结果详见表3，其中参加 I 组比对的实验室70 个，满意率为84.3%；参加 II 组比对的实验室78 个，满意率为88.5%；参加 III 组比对的实验室70 个，满意率为70.0%。 广东省食品检验所实验室参加能力验证测试结果详见表4，样品19E-381 和 19F-979 的 Z 值分别为-0.1 和-0.8。 根据评价原则∣Z∣≤2 为满意结果，2 份样品评价结果均为满意，可知广东省食品检验所实验室在霉菌和酵母计数上有较高的技术水平。

表1 不同培养基的霉菌计数结果

表2 不同培养基的酵母计数结果

表3 实验室间比对Z 值分布结果

表4 广东省食品检验所实验室能力验证测试结果

5 结论

通过采用不同厂家生产的不同培养基检测霉菌和酵母总数可以看出，各培养基由于组分不同，检测结果也不同。其中，孟加拉红琼脂上霉菌生长率高于马铃薯葡萄糖琼脂[8]，因为适当提高培养基碳氮比可以提高霉菌检出率，但葡萄糖的含量过高会降低霉菌的检出率。 通过此次霉菌和酵母菌的能力验证试验，从“人、机、料、法、环”5 个方面来考虑分析试验中的关键控制点，为今后检测提供参考。

人：检验人员应有较为丰富的检验检测经验，掌握目标菌的检验方法和菌落形态判定特征，能制定周全的试验方案，使整个试验有序平稳进行，确保结果不漏计、不误计。

机：实验室应配备满足检测工作要求的仪器设备[9]，检测设备的选择、性能和准确度会直接影响试验结果的可靠性。 因为旋转刀片均质器可能会把霉菌的菌丝切断，导致检验结果偏高[10]，应采用拍击式均质器混匀样液；培养箱的配置应考虑用途、控温范围、控制精度和数量的要求，培养箱内温度和湿度应设置得当，避免培养基失水过多而干裂。

料：考虑到目标菌可在不同培养基上生长以及不同厂家培养基质量也稍有不同， 而能力验证试验只能制备一个样品，为避免不可挽回的失误，此次能力验证中分别采用了2 个厂家（环凯和陆桥）、2 种培养基（孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂）进行霉菌和酵母菌计数和分析。 而且，孟加拉红见光易分解，需要避光保存，所以孟加拉红琼脂应配制于棕色瓶中，或用不透光袋子密封保存，放置于冰箱中，已变色的培养基应废弃，不再使用。

法：按照指定的方法处理样品，用稀释液反复冲洗装样品的西林瓶，确保目标菌全部转移；培养48 h后第一次观察，轻拿轻放，避免上下翻转平板导致的霉菌孢子扩散形成次生菌落，影响计数结果，之后每日观察并记录培养至第5 d 的结果；用肉眼观察霉菌和酵母，必要时可采用低倍显微镜或放大镜进行区分和计数，记录稀释倍数和相应的霉菌酵母结果，选取菌落数在10～150 CFU 的平板进行计数。

环：环境条件如温度、湿度、光照、强度、空气流动、磁场、震动、碰撞等，都可能通过影响标准设备的性能和准确度而影响实验室的检测结果[11]。 在试验时，应确保试验环境条件符合要求，有效地监控和记录环境条件，检测样品中的霉菌时，还要有适当的措施控制孢子在空气中的扩散。根据韩涛[12]等的研究，采用封闭式培养方法能有效防止霉菌孢子扩散，即用自封袋建立空气与培养基的体积比不小于3 的相对独立的微环境条件， 将霉菌培养皿放于其中隔离培养，代替传统的敞开式培养方法。