PCR 技术对肉制品中掺杂物的快速鉴定研究

马邯生

（邯郸职业技术学院 河北邯郸 056001）

1 前言

随着世界经济的快速发展，人们的生活水平不断提高，人们对食品的要求也随之提高，肉制品的质量问题受到广泛关注[1]。 随着科技的发展，社会中不乏一些商家为了利益，在肉制品中添加各种添加剂、防腐剂、瘦肉精，以低价格肉品代替高价格肉品，以次充好，导致食品安全问题频发，引起了社会对食品安全问题的广泛关注。 且由于我国当前尚没有动物源食品的鉴别检测技术标准方法，食品行业行政监管存在漏洞，市场上肉制品掺杂现象层出不穷，故根据聚合酶链式反应（PCR）技术开发出能够快速鉴定肉制品中掺杂物的方法尤为重要[2]。 本文主要从不同肉制品中提取其特异性靶基因并进行设计， 从而合成特异性的引物，再经单重和多重PCR 优化，确定检测不同肉制品的单重和多重PCR 方法，然后组装试剂盒，最后应用试剂盒对不同肉制品中的掺杂物进行快速鉴别研究。

2 资料与方法

本次研究主要运用了PCR 技术，PCR 技术是根据目的靶基因设计特异性引物，借助DNA 聚合酶体外大量扩增目的片段，是一种用于放大扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术[3]，能够将微量的DNA大幅增加，PCR 技术能够实现对特定核苷酸序列的特异性扩增，具有常规诊断方法无法比拟的准确性，且PCR 技术操作简单、检测快速、特异性强、灵敏度高，是当前食品安全检测、疫病检测中广泛使用的分子生物学快速检测技术[4]。 多重PCR 是在同一PCR反应体系里加上2 对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR 相同。 一般PCR 仅应用1 对引物，通过PCR 扩增产生1 个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。

2.1 研究方法

2.1.1 DNA 的提取

运用不同的方法提取肉制品中的DNA，并对方法不断优化，从而获得最适合的提取DNA 的方法。

2.1.2 引物设计

根据不同肉制品中提取的DNA，得到特异性的靶基因，利用Oligo 6.0 软件设计合成3 对特异性引物，并对引物的特异性进行试验检测。

2.1.3 单重PCR 反应条件的优化

影响PCR 反应的主要条件有退火温度、引物含量、DNA 模板含量等，对各个条件进行优化，从而确定最适合的退火温度、引物含量、DNA 模板含量等条件。

2.1.4 多重PCR 反应条件的优化

通过对单重PCR 的反应条件进行优化，得到试验结果后，在已知结果的条件下，依次对多重PCR的退火温度、引物含量、DNA 模板含量等主要条件进行优化，从而确定多重PCR 反应的最佳退火温度、引物含量、DNA 模板含量等主要条件。

分别以 45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃的退火温度进行PCR 反应，从而确定最佳退火温度。 分别以 2、4、6、8、10 μL DNA 或 cDNA 为模板进行反应，从而确定最佳DNA 模板含量。 在25 μL PCR 反应体系中分别加入各对引物（20 μmol/μL）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，从而确定最佳引物浓度。

2.1.5 特异性、敏感性、临床应用试验

运用优化后的多重PCR 反应条件，以不同肉制品中提取的DNA 为模板进行多重PCR 特异性检测试验。 将提取到的肉制品中的DNA 依次做10 倍系列稀释，每个稀释度取5 μL 为模板，用多重PCR 优化得到的最佳反应条件对不同浓度下的DNA 模板进行鉴定，确定检测方法的敏感性以及其应用效果。

2.1.6 PCR 产物的微芯片电泳检测

本试验使用MCE-202 MultiNA 微芯片电泳系统，具体操作参照其使用说明书进行。

2.2 数据分析及图像处理

利用Excel2010、SPSS19 软件进行数据处理和分析，利用MultiNA viewer 软件处理微芯片电泳图像。

3 结果与分析

3.1 检测单重PCR 扩增的产物

利用合成设计出的3 对引物进行单重PCR 反应，并进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果详见图1。

图1 单重PCR 反应结果

由图1 可知，3 对引物分别扩增出了 240 bp、415 bp、743 bp 的特异性片段，与预期目的片段大小相符。

3.2 多重PCR 反应条件的优化

在对多重PCR 反应条件的优化过程中，确定了最佳退火温度为50℃，最佳模板浓度为6 μL，最佳引物浓度为1.5 μL。 综上所述，三重PCR 的最佳条件为：预变性，94℃，5～10 min；变性，94℃，45 s～1 min；退火，50℃，1 min；延伸，72℃，1～1.5 min，30 个循环；最后一次延伸时间延长到10 min。

3.3 特异性试验

利用已知的多重PCR 反应的最适条件对不同肉制品中的掺杂物进行多重PCR 扩增反应，多重PCR扩增具有很好的特异性，结果详见图2。

图2 特异性试验结果

3.4 敏感性试验结果

将3 种DNA 的检测浓度分别进行10 倍系列梯度稀释，稀释至 10-4倍，取 5 μL 各稀释度 DNA 作为模板进行多重PCR 检测，检测结果详见图3。从图3可知，该多重PCR 检测方法最低可以检出10-3倍稀释的总模板。

3.5 重复性试验结果

经过3 次重复检测，所有样品检测结果均完全一致，可知多重PCR 扩增具有很好的重复性和稳定性。

图3 敏感性试验结果

4 讨论

肉制品中存在掺杂物一直是国际上受到广泛关注的问题，它并非是最近几年才出现，而是因为科学技术的提高以及检测技术、手段的不断完善，掺假问题不断被人们所发现。单重PCR 反应仅适用于一种掺杂物的检测，且检测速度效率过低，故需使用多重PCR 反应提高速度[5]。 通过研制针对不同肉制品的多重PCR 鉴别检测试剂盒，快速实现肉制品内掺杂物的鉴定，然后将试剂盒进行推广，使各机关以及公司使用该PCR 试剂盒对不同肉制品中的掺杂物进行快速鉴别检测，有利于提高肉制品质量，保障动物源食品的安全和人民群众的身体健康，从而产生巨大的经济效益和社会效益。

本次试验通过进行引物设计与合成、单重PCR反应条件优化、多重PCR 反应条件优化及反应的特异性、敏感性、重复性试验来设计PCR 试剂盒，进一步实现对肉制品中的掺杂物的鉴定研究， 此研究将传统方法中一系列的试验转化为一次性PCR 扩增，具有操作简便、快速等特点，便于批量检测，且与传统鉴定方法相比检测成本大大降低， 提高了检测质量和效率。 灵敏性、特异性及重复性试验表明，本方法灵敏度高、特异性强、稳定性好。故PCR 技术对肉制品的掺杂物进行快速鉴定前景广阔，能为当今社会的食品公共安全提供便利和保障。