葛花总黄酮对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜Müller细胞的保护作用△

罗影 左中夫 张俏 薛坤 刘畅 闵连秋

近年来，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)发病率逐年增高，一旦防治不当，患者可出现视力丧失[1]。高血糖症会触发一系列的不良反应，导致视网膜发生氧化应激反应[2]。Müller细胞为视网膜中最主要的神经胶质细胞，对维持视网膜正常功能尤为重要[3]。DR状态下会引起Müller细胞损伤，可导致视网膜细胞外谷氨酸含量异常增加，从而激活谷氨酸受体，对视网膜造成毒性反应[4]。葛花总黄酮(total flavonoids of pueraria，TFP)为中药葛花的提取物，现代药理学研究发现，其能降低血糖浓度并发挥强大的抗氧化应激功能[5]。有文献报道，TFP可有效降低1型糖尿病小鼠血糖浓度及清除体内过多的氧自由基，进而缓解糖尿病导致的认知功能障碍[6]。我们前期研究发现，TFP能降低血糖浓度并能对抗氧化应激反应，改善1型糖尿病大鼠肾脏损伤。但TFP对1型糖尿病大鼠视网膜的影响尚不清楚。本研究探讨TFP对DR状态下Müller细胞的影响及相关机制，为DR防治寻找新的药物提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物分组及模型制备取SPF级雄性SD大鼠60只，体质量为180～220 g [购自锦州医科大学，编号：SCXK(辽)2009-2017]。采用单次腹腔注射链脲佐菌素(55 mg·kg-1)制作大鼠糖尿病模型，72 h后检测血糖浓度，将血糖浓度>16.7 mmol·L-1的大鼠作为动物模型。将造模成功的糖尿病大鼠随机分成糖尿病组、TFP组及TFP+Brusatol组(Brusatol为核因子NF-E2相关因子信号通路抑制剂)，每组15只。另取15只正常大鼠作为对照组。依据文献[6]及预实验，TFP组给予TFP 200 mg·kg-1灌胃治疗，TFP+Brusatol组在TFP组基础上给予10 μL Brusatol(0.2 mg·L-1)玻璃体内注射给药(双侧眼球均给药)[7]。实验期间检测大鼠血糖浓度、体质量变化。12周后，进行各项指标检测。本实验遵循国家《实验动物管理条例》的规定。

1.1.2 主要试剂及仪器链脲佐菌素(美国Sigma公司)，TFP(锦州医科大学化学实验室提供，纯度大于85%)，神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)一抗(兔抗大鼠)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)一抗(兔抗大鼠)、细胞保护因子Nrf2一抗(兔抗大鼠)、血红素氧合酶-1(HO-1)一抗(小鼠抗大鼠)(英国Abcam公司)，谷氨酸试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量试剂盒(北京索莱宝公司)，倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)，石蜡切片机(德国SLEE公司)，水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样本制备及一般指标检测实验过程中检测大鼠空腹血糖、体质量。12周后，每组取5只大鼠，用40 g·L-1多聚甲醛固定后取出大鼠眼球进行石蜡包埋、切片，用于免疫组织化学染色及免疫荧光染色。每组取5只大鼠视网膜，制备上清，-20 ℃保存，用于Western blot检测。另外，每组取5只大鼠视网膜制成100 g·L-1匀浆液，-20 ℃保存，用于MDA含量、SOD活性及谷氨酸含量检测，三者均采用试剂盒检测。

1.2.2 免疫组织化学法检测大鼠视网膜GFAP蛋白表达经1.2.1制备的切片脱蜡后用PBS洗3次；取体积分数3%H2O2在室温条件下处理切片12 min，用PBS洗3次，每次3 min，随后采用体积分数3%山羊血清室温孵育30 min，不洗，滴加GFAP(1300)，4 ℃过夜；用PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，置室温30 min；用PBS洗3次，每次3 min，滴加SABC试剂，置室温30 min；用PBS洗3次，每次3 min，DAB显色，复染、脱水、透明封片后拍照；应用Image J软件分析GFAP表达阳性率。

1.2.3 免疫荧光染色检测大鼠视网膜Nrf2蛋白表达经1.2.1制备的切片脱蜡后用PBS洗3次，每次3 min；再用体积分数3%山羊血清+Triton X-100室温孵育30 min，不洗，滴加Nrf2(1500)，4 ℃过夜；用PBS洗3次，每次3 min，滴加荧光二抗，置室温1 h；用PBS洗3次，每次3 min，封片后显微镜下拍照观察。

1.2.4 Western blot检测大鼠视网膜Nrf2、HO-1及GS蛋白相对表达量BCA法测定蛋白含量，电泳时加入15 μL样品；经120 V电压电泳后，转膜，用血清白蛋白封闭2 h；加入一抗(Nrf2，16000；HO-1，180 000；GS，110 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗4次，每次5 min；加入二抗室温下孵育2 h，TBST洗4次，每次5 min；ECL显影，以β-actin为内参，用Image J软件分析灰度值，重复实验3次，取平均值。

1.3 统计学方法统计分析采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、血糖浓度的变化各组大鼠造模前体质量和血糖浓度差异无统计学意义(P>0.05)。造模12周后， 糖尿病组大鼠血糖浓度高于对照组，且均大于16.7 mmol·L-1；TFP组及TFP+Brusatol组血糖浓度均低于糖尿病组(均为P<0.05)；糖尿病组、TFP组及TFP+Brusatol组大鼠体质量均低于对照组(均为P<0.05)(见表1)。

表1 造模前后各组大鼠血糖浓度和体质量

2.2 各组大鼠视网膜谷氨酸和MDA含量以及SOD活性检测结果糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜谷氨酸含量均高于对照组(均为P<0.05)；TFP组谷氨酸含量低于糖尿病组(P<0.05)。糖尿病组和TFP+Brusatol组MDA含量均高于对照组，SOD活性均低于对照组(均为P<0.05)。TFP组MDA含量低于糖尿病组，SOD活性高于糖尿病组(P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠视网膜谷氨酸和MDA含量及SOD活性

2.3 各组大鼠视网膜GFAP 和Nrf2蛋白表达情况糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜GFAP蛋白表达阳性率均高于对照组(均为P<0.05)；TFP组GFAP蛋白表达阳性率低于糖尿病组(P<0.05)(见图1和表3)。将对照组Nrf2蛋白免疫荧光强度设定为100.00%，糖尿病组Nrf2蛋白免疫荧光强度高于对照组(P<0.05)。TFP组Nrf2蛋白免疫荧光强度高于糖尿病组(P<0.05)，而TFP+Brusatol组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见图2和表3)。

2.4 各组大鼠视网膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表达情况糖尿病组大鼠视网膜Nrf2蛋白表达高于对照组，糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜HO-1和GS蛋白表达均低于对照组(均为P<0.05)。TFP组大鼠视网膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表达均高于糖尿病组(均为P<0.05)，而TFP+Brusatol组与对照组大鼠视网膜Nrf2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)(见图3和表3)。

图1 各组大鼠视网膜GFAP蛋白表达变化(×200)

图2 各组大鼠视网膜Nrf2蛋白表达变化

表3 各组大鼠视网膜GFAP、Nrf2、HO-1及GS蛋白表达

图3 Western blot 检测各组大鼠视网膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表达情况 A：对照组；B：糖尿病组；C：TFP组；D：TFP+Brusatol组

3 讨论

预计到2025年，全球糖尿病患者人数将高达3亿[8]。随着病程的延长，糖尿病患者发生DR的概率增高。近年来，氧化应激与DR的关系已经被认可[9]。氧化应激在DR发病中的破坏性作用已在糖尿病实验动物模型中得到证实，而且研究发现，抗氧化剂在一定程度上可有效缓解DR[10]。Müller细胞在DR进程中至关重要，其损伤不仅可引起微血管病变，亦可造成神经损伤[11]。GFAP为一种中间丝结构蛋白，在Müller细胞内过度表达后可损伤视网膜神经元[12]。

随着中医药的发扬光大，天然中药提取物在治疗DR中扮演重要的角色。葛花为传统中药，又名葛条花，可清热消渴。TFP为葛花的有效活性成分之一，可有效降低1型糖尿病小鼠血糖浓度及清除体内过多的氧自由基，进而缓解糖尿病所导致的认知功能障碍。研究发现，具有抗氧化应激作用的药物褪黑素可抵抗氧化应激反应，进而保护受损的Müller细胞[13]。本实验中，TFP可明显降低1型糖尿病大鼠血糖浓度，同时可降低MDA含量，增加SOD活性，增加大鼠的抗氧化应激能力，最终表现为视网膜GFAP蛋白表达降低，谷氨酸含量明显下降，说明TFP对1型糖尿病大鼠视网膜的损伤存在抑制作用。

Nrf2具有促进各种抗氧化基因转录的作用。Nrf2可与Kelch-ECH结合蛋白1共价结合，当氧化应激增强时，结合蛋白1被氧化或共价修饰，从而引起Nrf2释放。随后，Nrf2进入细胞核并与ARE结合，调控抗氧化基因的表达。本研究发现，DR状态下大鼠视网膜Nrf2蛋白表达增加，这可能是DR时视网膜本身对氧化应激的适应性反应，然而HO-1蛋白表达却明显下降，说明DR时氧化应激反应过度，消耗了机体自身所产生的HO-1蛋白，进而导致氧化应激增强，造成Müller细胞损伤。而给予TFP治疗后，MDA含量降低，SOD含量增加，机体抗氧化能力增加，同时大鼠视网膜Nrf2、HO-1蛋白表达明显升高，提示TFP在一定程度上可以激活Nrf2蛋白的表达，上调HO-1蛋白的表达，进而对抗大鼠DR状态下氧化应激损伤，保护受损的Müller细胞。为了进一步验证TFP对DR状态下Müller细胞的保护作用机制，本研究在给予TFP的基础上进一步给予大鼠玻璃体内注射Nrf2抑制剂Brusatol，发现TFP的治疗作用被逆转，这进一步提示TFP是通过激活Nrf2/HO-1信号通路保护受损的Müller细胞。