艾塞那肽对4-羟基壬烯醛诱导人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的抑制作用△

崔俊 崔仁哲 刘熙文 田莲姬 卢迪 李慧瑛

老年性黄斑变性(senile macular degeneration,SMD)作为黄斑的退行性疾病，是导致全球老年人失明的最主要原因之一，且其患病率逐年增加[1-3]。虽然黄斑变性是由于多种因素导致的眼底病变的疾病，但年龄是引起SMD的最主要的危险因素之一，且高龄SMD患者死亡率不断增加[4]。SMD早期发病机制包括炎症、氧化应激等各种致病因素致使视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的异常生理功能，最终导致视力下降，甚至致盲[5]。随着年龄的增长，细胞的氧化损伤在衰老过程中起着重要的作用[6]，而氧化应激和自由基损伤是SMD的重要致病因素之一[7]。4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)是一种含氧α，β不饱和羟基烯醛，是一种氧化应激的重要生物标志物。4-HNE可以参与调节许多信号转导通路，从而调节细胞内多种功能活动[8]。研究提示，人RPE细胞中4-HNE结合蛋白的增加与SMD有着密切关系[9]。4-HNE作为一种氧化物质可用于诱导人RPE细胞氧化应激和细胞凋亡[10-11]。

艾塞那肽(exendin-4，EX4)作为一种与胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide,GLP-1)具有53%同源性GLP-1受体激动剂，具有抗炎、抗氧化等特性[12-13]。已有研究表明，EX4对RPE细胞具有保护作用，而且EX4在胰腺、心脏、肾脏等都有抗氧化作用[13-15]。但目前EX4对RPE细胞的保护作用及相关机制尚缺乏充足的研究。因此，本研究旨在探讨EX4对4-HNE诱导的RPE细胞氧化应激损伤的保护作用及机制，为其用于SMD的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料人ARPE-19细胞购于美国ATCC公司。EX4、4-HNE、DCFH-DA荧光探针(Sigma公司，美国)；DMEM/F12培养基(HyClone，美国)；胎牛血清、抗菌素(Thermo，美国)；CCK-8细胞活性检测试剂盒(Dojindo,日本)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(上海碧云天生物技术有限公司)；CO2培养箱(Thermo，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；酶标仪(BIOTEK，美国)；流式细胞仪(BD公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将ARPE-19细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基，并置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养，定期更换培养基并及时传代。取增殖旺盛、状态良好的第5-8代细胞用于后续实验。

1.2.2 CCK-8法筛选药物最佳浓度将ARPE-19细胞接种于96孔板，每孔200 μL细胞悬液，含5×103个细胞，细胞贴壁后更换无血清培养基，每孔加入不同浓度的EX4溶液100 μL培养24 h，EX4浓度分别为0 nmol·L-1、12.5 nmol·L-1、25.0 nmol·L-1、50.0 nmol·L-1、100.0 nmol·L-1。24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，置37 ℃培养箱内继续培养4 h。完全溶解后用酶标仪在450 nm波长下检测不同浓度EX4处理后光密度(D)值，计算细胞增殖率。

1.2.3 细胞分组根据前期4-HNE作用于ARPE-19细胞半数致死量浓度筛选，选择浓度10 μmol·L-1作为细胞模型加药浓度；根据CCK-8实验检测结果选择100.0 nmol·L-1作为EX4最佳浓度，将ARPE-19细胞分成4组。对照组：不做任何处理；EX4处理组：加入100.0 nmol·L-1EX4，作用24 h；4-HNE组：加入10 μmol·L-14-HNE作用细胞24 h；4-HNE+EX4处理组：加入100.0 nmol·L-1EX4预处理细胞24 h，再加入10 μmol·L-14-HNE作用细胞24 h。光学显微镜下观察各组RPE细胞形态。

1.2.4 荧光显微镜下观察各组细胞活性氧自由基生成将细胞接种于24孔板，每孔20×103个，待细胞贴壁后分别处理各组细胞，24 h后弃培养基，PBS冲洗 1 min，漂洗3次，加入10 μmol·L-1DCFH-DA，置于细胞培养箱避光孵育10 min，弃培养基后用PBS洗涤细胞3次，每组细胞加入PBS后在荧光显微镜下观察活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成。

1.2.5 流式细胞仪检测各组细胞内ROS含量将细胞接种于细胞培养皿中，贴壁后分别处理各组细胞，24 h后弃培养基，PBS洗涤细胞3次，加入含有10 μmol·L-1DCFH-DA的PBS，置37 ℃培养箱内继续培养 1 h。用胰蛋白酶消化收集各组细胞，离心后弃上清液，用PBS洗涤细胞2次，每管加300 μL PBS重悬细胞，放入流式细胞仪检测各组细胞内ROS生成量。

1.2.6 各组细胞内MDA、SOD水平测定将各组细胞接种于细胞培养皿中，细胞贴壁后分别处理各组细胞，24 h后离心收集各组细胞，取上清液，根据试剂盒说明书进行样品处理，使用酶标仪在对应波长处测定每孔D值，检测各组细胞MDA、SOD含量。

2 结果

2.1 不同浓度EX4对ARPE-19细胞增殖的影响CCK-8法检测结果发现，0 nmol·L-1及12.5 nmol·L-1、25.0 nmol·L-1、50.0 nmol·L-1、100.0 nmol·L-1EX4处理后的细胞增殖率分别为100.00%±0.91%、100.23%±0.47%、105.12%±1.32%、110.69%±2.29%、118.92%±1.92%，其中25.0 nmol·L-1、50.0 nmol·L-1EX4处理组与0 nmol·L-1EX4处理组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。EX4在浓度为100.0 nmol·L-1时细胞增殖率最高。

2.2 光学显微镜下各组细胞形态对照组细胞致密、形态规整；EX4处理组细胞致密、均匀，增殖能力强；4-HNE组细胞数量明显减少，形态欠佳，分布呈团簇状；4-HNE+EX4处理组细胞形态良好、细胞长势均匀、细胞增殖速度尚好、细胞间可见损伤的碎片。EX4处理组与对照组相比，细胞形态无明显改变(图1)。

图1 光学显微镜下观察培养24 h后各组RPE细胞状态

2.3 荧光显微镜下EX4对各组细胞ROS生成的影响采用荧光标记法检测各组细胞内ROS变化情况，生成的ROS呈亮绿色高荧光。对照组和EX4处理组ARPE-19细胞中几乎无亮绿色高荧光，而4-HNE组细胞内亮绿色高荧光含量明显高于对照组。与4-HNE组相比，4-HNE+EX4处理组细胞内亮绿色高荧光含量明显减低(图2)。

2.4 EX4对各组ARPE-19细胞的细胞增殖和ROS水平的影响4-HNE组细胞增殖率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，4-HNE+EX4处理组细胞增殖率高于4-HNE组，差异有统计学意义(P<0.05)。EX4处理组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。对照组细胞内ROS水平与4-HNE组相比差异有统计学意义(P<0.01)，4-HNE+EX4处理组细胞内ROS水平低于4-HNE组，差异有统计学意义(P<0.05)；EX4处理组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

图2 EX-4对各组ARPE-19细胞内ROS生成的影响

2.5 EX4对各组ARPE-19细胞内SOD、MDA含量变化的影响对照组与EX4处理组细胞内SOD、MDA含量比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；与对照组比较，4-HNE组细胞内SOD含量明显降低，MDA含量明显升高，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与4-HNE组比较，4-HNE+EX4处理组细胞内SOD含量明显升高，MDA含量明显降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

表1 各组细胞增殖率、ROS、氧化应激指标比较

3 讨论

随着社会人口老龄化程度增加，SMD的患病率明显增高，致使SMD成为老年人视力下降，甚至失明的重要原因之一[16]。虽然SMD已成为国内外眼科学研究的热点，但目前SMD的发病机制尚未完全清楚，临床上也缺乏理想的治疗方法，有效的治疗药物研究是必不可少的。RPE细胞作为血-视网膜屏障的主要组成部分，当氧化应激损伤导致RPE细胞损伤时，容易引起玻璃膜疣沉积[17]。本研究中，我们以4-HNE诱导ARPE-19细胞损伤作为体外模型模拟SMD，发现在给予4-HNE处理后细胞活性显著降低，而100.0 mmol·L-1EX4对已损伤的ARPE-19细胞具有较好的保护效果，能有效对抗氧化应激引起的细胞损伤。

ROS增多是氧化应激损伤的直接指标，ROS增多可促使抗氧化剂水平降低，导致线粒体功能受到损害，可引起RPE细胞的凋亡[18]。长期氧化应激损伤可以导致RPE细胞结构改变、功能异常，进一步引发SMD[19]。我们拟进一步观察4-HNE是否引起氧化应激损伤，结果显示相对于对照组，4-HNE组ARPE-19细胞内ROS生成明显升高，SOD含量显著降低，MDA含量显著增高，证实了4-HNE可以引起氧化应激损伤。

EX4是一种与GLP-1具有53%同源性的GLP-1受体长效激动剂，具有抗氧化功能，保护细胞结构和功能不被破坏，抑制进一步的氧化应激损伤[20]。EX4还具有抗炎、抗氧化、抗癌、降低血糖等功效[13-15]。Yasuda等[21]研究认为，EX4增加视网膜内皮细胞内SOD含量引起抗氧化效果，从而抑制糖尿病视网膜病变的进展。本研究结果显示，4-HNE+EX4处理组RPE细胞内SOD含量明显高于4-HNE组，而MDA含量则明显低于4-HNE组。SOD具有清除氧自由基的功能，MDA可以反映细胞内自由基反应程度，这两种抗氧化酶反映细胞清除ROS的能力。Kim等[13]认为，在胰腺β细胞中，EX4通过激活Nrf2信号通路调节抗氧化蛋白，从而抑制H2O2导致的氧化应激损伤。EX4的作用途径和作用机制目前尚未清楚，但普遍认为是通过多种信号通路的激活和抑制等相互作用引起的。

综上，本研究通过观察EX4对4-HNE诱导人RPE细胞氧化应激损伤的抑制作用，初步探讨了EX4在抗氧化应激损伤方面的作用。4-HNE诱导氧化应激损伤的具体分子机制以及EX4对抗氧化应激损伤的作用机制仍需进一步探讨。