晚期糖基化终末产物受体(RAGE)在糖尿病性白内障和年龄相关性白内障患者前囊膜及人晶状体上皮细胞中的表达△

刘玉梅兰 杜珊珊 邵敬芝 张凤妍

糖尿病患者白内障的发病率比普通人群增高5倍，提前约10 a，糖尿病被列为白内障手术并发症的高风险因素[1]，因此，对糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)的机制研究至关重要。DC的发病机制较为复杂，目前有多种学说[2-5]，其中蛋白质的非酶糖基化反应学说被广泛接受，而晚期糖基化终末产物(advanced glycation endproducts，AGEs)及其受体(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)又在这一机制中发挥着重要的作用。晶状体蛋白在无需酶催化的条件下，可以和葡萄糖反应，生成稳定不可逆转的产物AGEs[6]。AGEs与其受体RAGE结合后，通过激活核因子-κB(NF-κB)[7-8]、磷脂酰肌醇3-激酶/分子蛋白激酶B[8]等途径，促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6等炎症因子的表达，使蛋白质变性，晶状体透明度下降，进而形成白内障[9]。本实验通过检测RAGE在DC与年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)患者前囊膜及不同浓度高糖条件下培养的人晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)中的表达情况，为进一步研究此机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源选取郑州大学第一附属医院眼三科2018年5月至2019年2月确诊为白内障的50例(60眼)患者，收集其临床资料及晶状体前囊膜，其中DC患者26例(30眼)，ARC患者24例(30眼)，所有患者均签署知情同意书。由同一手术医师行超声乳化白内障摘出+人工晶状体植入术，术中连续环形撕囊后取得前囊膜。所有标本离体后立即放入4 ℃冰箱，待手术结束后放入-80 ℃冰箱保存。

1.2 患者入组标准DC组：(1)经眼科确诊为白内障；(2)经内分泌科确诊为2型糖尿病；(3)排除外伤性白内障、药物及中毒性白内障、放射性白内障等其他有明显诱因的白内障；(4)排除青光眼、高度近视、眼外伤等其他眼病史及眼部手术史；(5)排除高血压、心脏病、甲状腺功能亢进等对全身代谢状况影响较大的疾病；(6)年龄为50～89岁。ARC组：无糖尿病，其余入组标准同DC组。

1.3 临床资料采集记录DC患者的年龄、糖尿病病程及HbA1c水平。其中HbA1c水平由患者入院后采静脉血经检验科测定，以HbA1c<6.5%为正常值。记录ARC患者的年龄。

1.4 主要试剂兔抗人RAGE单克隆抗体(6996S，11000，美国CST公司)；羊抗兔二抗(SA00001-2，15000，武汉三鹰生物技术有限公司)；人LECs细胞株(HLE-B3细胞)(上海吉凯因化学技术公司)；低糖DMEM细胞培养液(DMEM)、胎牛血清(FBS)(美国HyClone公司)；流式凋亡试剂盒(556547，英国BD公司)；D-葡萄糖(美国Sigma公司)。

1.5 方法

1.5.1 前囊膜标本分组ARC患者根据年龄分为ARC1组(50～69岁)和ARC2组(70～89岁)。DC患者根据年龄及HbA1c水平，分为DC1组(50～69岁，HbA1c为>7.0%～12.0%)、DC2组(50～69岁，HbA1c为4.0%～7.0%)、DC3组(70～89岁，HbA1c为>7.0%～12.0%)、DC4组(70～89岁，HbA1c为 4.0%～7.0%)。

1.5.2 RAGE在白内障患者前囊膜中表达的检测对前囊膜组织进行蛋白提取，将已经分组的前囊膜组织分别置于培养皿中，加入预冷的细胞裂解液与蛋白酶抑制剂的混合液，将培养皿置于冰上30 min，每 5 min用细胞刮刀研磨组织，直至组织完全破碎裂解，用细胞刮刀将组织刮于一侧，然后将组织连同裂解液一起转移至EP管中，离心后吸取上清至新的EP管中。BCA法进行蛋白定量，Western blot检测前囊膜中RAGE表达量，取等量蛋白上样，以β-actin为内参，120 g·L-1SDS-PAGE凝胶电泳，湿式转膜至PVDF膜，含 50 g·L-1脱脂奶粉的缓冲液封闭1 h，PBS洗涤，加入一抗，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤，加入相应二抗孵育，室温平缓摇动1 h；PBS洗涤，ECL 化学发光法曝光显像。

1.5.3 人LECs培养直径6 cm培养皿中添加含体积分数10%FBS和10 g·L-1青-链霉素的DMEM 低糖培养液，接种HLE-B3细胞，置于37 ℃、 含体积分数5%CO2的细胞培养箱中，第2天换液，观察细胞生长状况。待细胞生长融合达80%以上进行消化，按14进行传代。光学显微镜下观察所培养细胞的形态，取处于对数生长期的HLE-B3细胞(第2～10代)接种于6孔板上进行后续实验。依据培养液不同将人LECs分为：A0组：DMEM 培养液；ARC1组：添加10 mmol·L-1葡萄糖的培养液；ARC2组：添加20 mmol·L-1葡萄糖的培养液；A3组：添加30 mmol·L-1葡萄糖的培养液；A4组：添加30 mmol·L-1甘露醇的培养液。每组设2个复孔。所有培养液均添加体积分数10%FBS和10 g·L-1青-链霉素，分别培养48 h。

1.5.4 RAGE在人LECs中表达的检测弃去细胞培养液，冰上每孔加入50 μL蛋白裂解液提取蛋白，反复吹打，冰上放置15 min，将细胞与裂解液一起转移至EP管中，离心后取上清，BCA法进行蛋白定量，Western blot检测各组HLE-B3细胞中RAGE蛋白表达量。

1.5.5 细胞凋亡率测定再次进行48 h的各组细胞培养，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书处理，将6孔板中的培养液全部吸入离心管，胰蛋白酶消化收集细胞。4 ℃下1000 r·min-1离心5 min，弃去上清。加入缓冲液重悬细胞后每管加入5 μL Annexin V-FITC液，室温避光孵育15 min，上机前加入5 μL PI液，1 h内完成检测，记录HLE-B3凋亡率。

1.6 统计学方法采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。首先对数据进行Kolmogorov-Smirnov检验，若符合正态分布采用单样本的t检验，若不符合则采用Wilcoxon检验，对比各组细胞的凋亡率及RAGE蛋白表达灰度值的差异。细胞凋亡率与葡萄糖浓度的相关性采用Spearman秩相关分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 RAGE蛋白在白内障患者前囊膜中表达Western blot检测各组白内障患者前囊膜中RAGE蛋白表达相对强度，即RAGE蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值之比为：ARC1组0.243，ARC2组0.396，DC1组0.645，DC2组0.465，DC3组0.711，DC4组0.432。DC1组高于DC2组，DC3组高于DC4组，均分别高于相应年龄的ARC1和ARC2组(图1)。

图1 Western blot检测各组白内障患者前囊膜中RAGE蛋白表达条带

2.2 RAGE在人HLE-B3中表达Western blot检测人HLE-B3内RAGE蛋白表达相对强度，即RAGE条带灰度值与β-actin条带灰度值之比为：A0组0.163±0.020，A1组0.248±0.020，A2组0.293±0.034，A3组0.346±0.021，A4组0.176±0.011。RAGE蛋白在A1、A2、A3组表达均高于A0组，差异均有统计学意义(均为P=0.001)；RAGE蛋白在A1、A2、A3组表达也均高于A4组，差异均有统计学意义(均为P<0.001)(见图2)。

图2 Western blot检测各组人HLE-B3中RAGE蛋白表达条带

2.3 各组细胞凋亡率流式细胞仪检测不同培养液下HLE-B3凋亡率：A0组为(3.670±0.006)%，A1组为(8.830±0.011)%，A2组为(12.330±0.018)%，A3组为(22.270±0.025)%，A4组为(3.800±0.013)%。A1、A2、A3组HLE-B3凋亡率高于A0、A4组，差异有统计学意义(P=0.002)；A1、A2、A3组细胞凋亡率高于A4组，差异有统计学意义(P=0.002)。A1、A2、A3组细胞凋亡率与培养液葡萄糖浓度呈正相关(r=0.892，P<0.001)(见图3)。

图3 流式细胞仪检测各组HLE-B3凋亡率 注：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞；右上象限是晚期凋亡细胞及死细胞；而右下象限为早期凋亡细胞

3 讨论

蛋白质的非酶糖基化是指机体在无需酶催化的条件下，蛋白质和葡萄糖之间自发形成糖基化蛋白的过程。糖化的过程首先是还原性葡萄糖的羰基和蛋白质的游离氨基酸，主要是赖氨酸和精氨酸，反应生成不稳定的Schiff碱或美拉德产物。美拉德产物经过分子重排、脱水和缩合，形成性质稳定、不可逆交联的AGEs[6]。这一反应广泛存在，虽缓慢却不可逆转。晶状体约90%的成分为蛋白质[10]，且其是机体中的长寿蛋白之一，一旦合成终身存在于晶状体中。因此，糖尿病患者的晶状体蛋白更容易发生该反应，进而诱发级联反应，最终导致蛋白质变性，DC形成。

AGEs的受体RAGE是来自IgG超家族的细胞表面受体，相对分子质量为45 000～55 000[11-12]，由细胞外区的3个Ig样结构、单次跨膜螺旋机构和细胞质尾区组成。RAGE在蛋白的转录过程中可以发生广泛剪接，形成多达20余种亚型[13]。其中，可溶性RAGE有同配体结合的细胞外结构区域，然而缺乏细胞内的信号转导结构，同AGEs竞争性结合后可以阻止其同其他亚型结合，进而无法进行细胞内氧化凋亡级联反应。可溶性RAGE及esRAGE的体内注射是阻止糖尿病进展研究的一个热点[14]。本实验所购买的CST公司的兔抗人RAGE单克隆抗体，靶向结合相对分子质量为55 000的RAGE蛋白，故选择β-actin作为内参。从前囊膜RAGE蛋白灰度值分析的柱状图可以直观看出：(1)ARC患者中，A2组灰度值大于A1组，说明ARC患者年龄越大，前囊膜的RAGE表达越高；(2)DC患者中，D1组灰度值大于D2组，D3组大于D4组，说明DC患者HbA1c水平越高，前囊膜的RAGE表达越高，RAGE蛋白表达与糖尿病严重程度有关；(3)DC患者灰度值均高于ARC患者，说明RAGE蛋白在DC患者中表达高于ARC患者。

DC的发病机制较为复杂，目前有多种学说，除蛋白质的非酶糖基化外，还有如离子泵被破坏导致的渗透压失衡[3]、多元醇通路代谢异常[5,15]、脂质过氧化[5]等学说。为了排除复杂的体内环境中各种因素的影响，本研究设置了体外细胞实验，为排除渗透压的影响，在细胞培养中设置了甘露醇高渗对照组，培养液添加葡萄糖组的RAGE蛋白表达灰度值高于DMEM培养液组，培养液添加葡萄糖组的细胞凋亡率高于DMEM培养液组。葡萄糖组的细胞凋亡率与添加的葡萄糖浓度呈正相关。说明培养液葡萄糖浓度越高，RAGE蛋白表达程度越高，细胞凋亡率越高，30 mmol·L-1以内溶质所产生的渗透压对RAGE蛋白表达及所培养细胞凋亡率的影响无显著意义。RAGE蛋白在体外高糖环境下高表达的细胞培养结果，与RAGE蛋白在DC患者前囊膜高表达的标本检测结果相互验证，为蛋白质的非酶糖基化理论提供了证据。

AGEs可以直接修饰晶状体蛋白导致其变性。αB-晶状体蛋白在晶状体中大量存在，具有分子伴侣功能，可以与部分未折叠的蛋白质相互作用以阻止聚集，维持晶状体的透明度。Nandi等[16]将AGEs与αB-晶状体蛋白共价修饰表达，发现糖基化的αB-晶状体蛋白交联程度增高，分子伴侣功能明显减弱。此外，AGEs可以同RAGE结合，诱发氧化损伤级联反应，导致晶状体蛋白质变性和细胞凋亡，白内障形成。然而RAGE的胞质尾区较短，缺乏酶活性，并且有可能是无结构化的，因此有较为复杂的多种细胞内转接子呈递的信号转导通路。Hudson等[17]通过酵母双杂交系统，发现了重要的细胞质转接子Diaphanous-1(Dia-1)。RAGE募集Dia-1后，由于缺少磷酸化靶点，需要添加一种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)DOCK7后，可以激活GTP酶Rac1和Cdc42，加快细胞运动。由于RAGE与Toll样受体TLR4在下游信号转导方面极为相似，进一步研究发现，RAGE的胞质尾区氨基酸序列与TLR4有共同的“RT序列”[18]，结构极为类似，故而也可以结合TIRAP及MyD88等转接蛋白。 RAGE-TIRAP/MyD88信号轴可以导致NF-κB的活化。被激活的NF-κB能够刺激凋亡诱导基因及死亡受体的表达，并且促进细胞凋亡的炎症介质和酶的转录，产生大量炎症因子、生长因子，如TNF-α、白细胞介素-6等，使细胞组织发生病理改变。此外，有研究表明，NF-κB的活化可以促进RAGE的表达[19]，进一步同AGEs结合，构成一种正反馈调节系统。

综上，RAGE在DC患者前囊膜及高糖条件下培养的人LECs中高表达，表明RAGE可能参与了白内障的形成，并加速了糖尿病患者的白内障进展，具体的发生机制还需进一步深入研究。