大豆胞囊线虫病抗性候选基因GmPEBP4-1克隆及表达分析

郭 杨，陈立新，姜海鹏，战宇航

（1.黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，哈尔滨 150086；2.黑龙江省农业科学院园艺分院，哈尔滨 150069；3.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

大豆胞囊线虫病（Soybean cyst nematode，SCN）是由大豆胞囊线虫（Heterodera glycinesIchinohe）引起的世界性大豆病害，给大豆生产造成毁灭性损失[1]。SCN分布广、危害重、其休眠体（胞囊）存活时间长，是一种极难防治的土传性病害。SCN可被划分为多个生理小种，不同生理小种分布和致病程度不同，在我国大豆主产区1号、3号、4号生理小种分布最广、出现频率最高，其中4号生理小种致病力最强[2]。主要有轮作倒茬、化学药剂、生物防治、合理施肥等防治措施，但效果不理想。选育和利用抗病品种是比较经济、安全、有效的控制SCN方法[3]。目前，国际上使用最多的SCN抗源为PI88788和Peking（PI548402），但过度使用有限抗源已导致SCN群体转移，失去对SCN的抗性[4]。因此，培育新SCN抗源对大豆生产发展具有重要作用。

常规育种由于周期长，优良性状和不良性状紧密连锁，不易选育出具有多种优良性状的大豆抗性品种。随着分子生物学快速发展，通过基因工程和分子育种技术发掘和利用大豆胞囊线虫抗性基因，已成为常规育种外极具潜力的培育抗胞囊线虫大豆品种方法[5]。

SCN是一种受多基因控制的复杂数量性状[6]。Cook等研究表明rhg1位点抗性由串联排列的具有色氨酸/络氨酸透性酶结构域的转运子、SNAP蛋白和具有创伤诱导蛋白结构域的蛋白等3个基因拷贝数共同决定[7]。Liu等研究表明Rhg4位点抗性由丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxyl methyltransferase，GmSHMT）决定，抗病品种和感病品种SHMT编码区内单核苷酸突变（SNP）使SHMT酶底物结合位点氨基酸不同，致使成熟蛋白在催化性状方面表现差异，影响合胞体内叶酸平衡，最终造成合胞体细胞环境改变导致线虫死亡[8]。除rhg1和Rhg4位点外，Lin等研究表明水杨酸合成代谢及信号转导途径中GmSAMT基因发挥重要作用，在大豆根中表达显著提高SCN抗性[9]。目前为止，这些抗性基因仅解释部分抗源中SCN抗性，所以挖掘新抗病基因对SCN抗性育种及解析SCN抗性机制具有重要意义。

磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP）基因家族在植物、真菌、昆虫和人类中广泛存在。该基因家族在植物成花转变、种子发育和萌发中发挥重要作用。目前，已在拟南芥、水稻、玉米和大豆等多种植物中分离较多PEBP基因[10]。通过研究PEBP基因家族功能发现，PEBP蛋白在植物体内参与MAPK/ERK信号通路调节细胞分化、迁移和黏附，NFKB信号通路调节细胞凋亡，GPCR信号通路调控G蛋白信号转导等多个胞内信号通路[11]。目前PEBP功能研究主要集中在哺乳动物及模式作物拟南芥，大豆研究报道较少。转录组测序技术广泛应用于大豆胞囊线虫病抗性基因筛选[12]。所以本研究利用抗病材料东农L-10转录组测序结果，选取在大豆胞囊线虫4号生理小种胁迫后差异表达的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）基因，命名为Gm-PEBP4-1。利用RT-PCR技术克隆抗病候选基因GmPEBP4-1，在生物信息学基础上利用qRT-PCR技术分析该基因在抗、感SCN病材料中基因表达量。初步探讨GmPEBP4-1基因在大豆胞囊线虫胁迫后响应，以期为SCN抗性育种提供抗病基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

抗大豆胞囊线虫病材料“东农L-10”、“东农L-204”、“Kangxian2”和感病材料“黑农37”、“ 绥农14”、“绥农10”种子取自东北农业大学农学院大豆生物学教育部重点实验室。大豆胞囊线虫4号生理小种（HG type 1.2.3.5.7）采自东北农业大学大豆研究所试验田，经Riggs和Schmitt鉴别模式[13]，鉴定结果为大豆胞囊线虫4号生理小种。

将东农L-10种子在蛭石+草炭土（1∶1）中萌发，萌发后移栽至装满蒸气杀菌砂盆中。将苗期幼苗放入生长室水桶。大豆在自然光周期生长室中培养，采用随机完全区组设计，3个重复，每个重复10株。每株幼苗接种约2 000条幼虫（J2）。分别于接种后0、7 d随机选择SCN接种的根，酸性品红染色，以确认感染成功。采集接种成功根样，用于转录组测序。

选取尺寸一致抗大豆胞囊线虫病材料和感病材料种子种于蛭石+草炭土（1∶1）中，在温室中（28℃/25℃、16 h光照/8 h黑暗、相对湿度70%）培养至苗期，幼苗接种约2 000条幼虫（J2），酸性品红染色，以确认感染成功。分别于接种后0、3、7、10 d随机选择3株SCN接种和未接种大豆根样，用于基因表达分析。

1.2 大豆总RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法提取大豆根系总RNA，2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。Nanovue超微量紫外分光光度计检测纯度及浓度。使用SYBR Prime-Script RT-PCR Kit试剂盒反转录提取RNA，得到cDNA。

1.3 转录组数据分析

将cDNA送往北京华大测序公司作RNA-Seq分析。使用Illumina HiSeq2000平台产生用于从头组装的100 bp成对末端序列读物。在Illumina HiSeq 2000平台上，采用50 bp单端读数对文库测序，作RNA-Seq分析。根据基因处理前后表达量，筛选胁迫后明显上调基因。

1.4 基因克隆

通过在线程序Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）查找GmPEBP4-1基因序列，利用Primer primier 5.0软件设计特异引物，引物为GmPEBP4-1F：AGAACACGGGGGACTATGTCTAGGCTCATGGAACC

GmPEBP4-1R：ATCCTCTGTTTCTAGTCACCT CCTTCTTGCAGCAG，以东农L-10 cDNA为模板作特异性扩增。PCR扩增体系20 μL，DNA模板1 μL、10×PCR butter 2 μL、2.5 mmol·L-1dNTP mix 0.2 μL、引物 F 0.5 μL、引物 R 0.5 μL、Taq酶0.3 μL、ddH2O 15.5 μL。PCR反应程序为：预变性94℃，5 min；变性94℃，10 s；退火60℃，30 s；延伸温度：72℃，30 s，共36个循环，4℃保存。将所扩增片段连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌感受态DH5ɑ，挑取阳性克隆送至北京华大公司测序，利用DNAMAN软件比对测序结果。

1.5 生物信息学分析

利用在线程序ProtParam（http://web.expasy.org/prot-param/）分析GmPEBP4-1蛋白理化性质；利用在线软件ExPASy-ProtScale（http://www.Expasy.org/tools/protscale.html）预测编码蛋白疏水性/亲水性；利用在线软件NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）分析蛋白结构域；利用在线程序SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测蛋白二级结构；利用MEGA7软件构建系统发育树，采取遗传距离建树相邻连接法；通过大豆基因数据库Phtozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），选取候选基因上游2 000 bp分析启动子，并在Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析软件上分析基因启动子顺式作用元件。

1.6 GmPEBP4-1基因表达分析

GmPEBP4-1基因序列，利用Primer primier 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物，引物为F：TTCGATCCCTTCACTTTGC，R：AGGACTTGGAGCATC TGGG。内参基因选取大豆管家基因Actin 4，引物序列为Actin 4F：GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA，Actin 4R：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT。应用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Life technologies，USA），以4个时间点处理和对照根系cDNA为模板，作qRT-PCR扩增。荧光反应体系参照SYBR®Select Master Mix试剂盒（TaKaRa）说明书，PCR反应体系20 μL，Green Premix Ex TaqTMII（2×）10 μL，上游引物（10 ng·mL-1）0.8 μL，下游引物（10 ng·mL-1）0.8 μL，，模板2 μL， ddH2O 6.4 μL。 反 应程 序 ：95 ℃ 30 s，95℃3 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环。采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量[14]，设置3次独立技术重复和3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 GmPEBP4-1基因序列克隆及生物信息学分析

选取在蛭石中培养15 d后东农L-10根部组织提取总RNA，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，18S和28S带型清晰（见图1），无明显降解，利用Nanovue超微量紫外分光光度计检测提取RNA，OD260/280均在1.96～2.1，表明提取RNA完整性好，纯度较高，可用于反转录。

以反转录后cDNA为模板，利用GmPEBP4-1克隆引物对其作PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2，GmPEBP4-1基因扩增片段长度为500 bp左右，与预期519 bp一致，将PCR扩增产物测序比对，结果见图3，与参考序列相同，证明PCR扩增结果正确。

通过ExPASy-ProParam分析GmPEBP4-1（Glycine max Wm82.a2.v1）基因序列编码蛋白质理化性质，结果表明，GmPEBP4-1编码172个氨基酸，ExPASy-ProParam蛋白分子质量为19.34 ku，原子总数为2 716个，化学式为C854H1358N246O249S9，不稳定指数（Instability index，II）52.58（大于40.0），是一种不稳定蛋白，脂肪系数76.98，总平均亲水性-0.337。进一步分析氨基酸组分显示（见图4），精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和缬氨酸（Val）占比最高，等电点为9.16，含有19个负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）和22个正电荷氨基酸残基（Arg+Lys），预测为酸性蛋白。通过在线工具ExPASy-ProScale预测分析编码蛋白疏水性（见图5），GmPEBP4-1蛋白在126-149位氨基酸有最强亲水性，其在第141位处有最强亲水峰值-3.189；在第14-29位氨基酸区域有较强疏水性，其中第155处有最大疏水性峰值1.911。亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，属于亲水性蛋白。通过NCBI CDD（Conserved Protein Domain Family）分析GmPEBP4-1蛋白保守结构域（见图6），该基因保守结构域为磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP，PF01161）结构域，存在8个底物结合位点。对该基因蛋白质二级结构预测得到其TM螺旋长度主要存在4种结构（见图7），分别为16.28% α-螺旋（Alpha helix，Hh）、25.58%延伸链结构（Extended strand，E）、4.07%β-转角结构（Beta turn）及54.07%无规则卷曲结构（Random coil）。从NCBI数据库中选取与大豆GmPEBP4-1蛋白相似性较高的8种蛋白氨基酸序列，构建系统进化树，根据不同物种亲缘远近可分为两组（见图8），大豆（Glycine max）、相思子（Abrus precatorius）、胡桃（Juglans regia）、树棉（Gossypium arboreum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、番木瓜（Carica papaya）、菜豆（Phaseolus vulgaris）聚为一组，拟南芥（Arabidopsis thaliala）、长蒴黄麻（Corchorus olitorius）聚为一组。两个分组中，大豆GmPEBP4-1蛋白与相思子PEBP蛋白亲缘性最高。

从大豆基因组数据库（Phytozome）中搜索到GmPEBP4-1基因序列，截取ATG上游2 000 bp序列，输入Plant CARE在线分析系统中分析启动子发现，该基因上游存在35种顺式作用元件，其中CGTCA-motif、TGACG-motif为控制茉莉酸甲酯（MEJA）顺式作用元件，在响应生物和非生物胁迫中发挥重要作用；TCT-rich repeats，P-box和ABRE为应激、胁迫响应相关元件（见图9），推测该基因可感知逆境胁迫并参与抗逆变化。

2.2 GmPEBP4-1基因表达分析

为进一步验证大豆GmPEBP4-1基因是否在抗病过程中发挥作用，在大豆胞囊线虫4号生理小种侵染不同阶段，利用qRT-PCR分析该基因在抗病材料东农L-10、东农L-204、Kangxian2和感病材料黑农37、绥农14、绥农10表达量。由图10可知，抗病品种在大豆胞囊线虫胁迫后3、7、10 d，GmPEBP4-1基因表达量较对照均显著提高，表现先升后降趋势，并在7 d时表达量最高。在感病品种黑农37中，大豆胞囊线虫胁迫7 d时GmPEBP4-1基因表达量最高，3和10 d时Gm-PEBP4-1基因表达量较对照变化不显著。由结果可知，GmPEBP4-1基因在大豆胞囊线虫4号生理小种胁迫过程存在响应，但在抗病品种和感病品种中基因表达模式存在差异。

3 讨论与结论

本研究利用抗病材料东农L-10转录组测序结果，筛选出受大豆胞囊线虫4号生理小种胁迫差异表达基因GmPEBP4-1。利用RT-PCR技术成功克隆GmPEBP4-1基因，经生物信息学软件分析发现，该基因CDS序列全长519 bp，编码172个氨基酸，是一种亲水性蛋白。氨基酸组分中精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和缬氨酸（Val）占比最高；等电点为9.16，初步预测为酸性蛋白。其编码的蛋白质含有无规则卷曲（54.07%）、延伸链（25.58%）、α-螺旋（16.28%）和β-转角（4.07%）。系统进化树分析表明，大豆GmPEBP4-1蛋白与相思子PEBP蛋白同源性最高，亲缘性最近。GmPEBP4-1蛋白保守结构域分析显示含有保守PEBP（PF01161）结构域，与张礼凤等[15]大豆PEBP基因家族均具有保守PEBP结构域研究结果一致。

启动子顺式作用元件为同一DNA分子中具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其他调控基序，在基因转录起始调控中发挥重要作用；本研究通过PlantCARE在线预测软件分析GmPEBP4-1基因上游2 000 bp序列启动子元件，发现该基因上游存在（TCT-rich repeats，P-box、ABRE）与应激、胁迫相关元件。表明该基因可感知逆境胁迫并参与抗逆变化，与刘瑞芬等磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因与小麦抗寒能力研究结果一致[16]。同时在该基因启动子中还发现（CGTCA-motif、TGACG-motif）控制茉莉酸甲酯（MEJA）顺式作用元件，表明利用叶面喷施茉莉酸有效降低线虫在易感番茄中繁殖能力，提高防御能力[17]；在茉莉酸处理条件下，可提高温度敏感的抗线虫基因在高温处理下抗性[18]；大豆防御SCN侵染反应中，茉莉酸部分合成途径在植物防御系统中表现为上调[19]；在大豆中过表达参与茉莉酸类JA/JA-Ile途径3个拟南芥基因（AtAOS、AtAOC和AtJAR），提高其SCN抗性[9]。在水稻抗根结线虫研究中发现，外施茉莉酸甲酯（MeJA）导致线虫跟植物互作活力降低，植物抗性增强[20]；这些结果说明茉莉酸作为一种内源生长调节物质，参与抗线虫反应。因此，存在茉莉酸甲酯（MEJA）顺式作用元件的GmPEBP4-1基因可能在抗大豆胞囊线虫反应中发挥作用。

当植物受外界胁迫时，防卫基因可被多种因子诱导，引起新基因表达和原有基因活化，抵御外界胁迫[21]。本研究中，在大豆胞囊线虫4号生理小种胁迫下，利用qRT-PCR分析抗病品种东农L-10、东农L204、Kangxian2和感病品种黑农37、绥农14、绥农10中GmPEBP4-1基因表达量，结果表明GmPEBP4-1基因在大豆胞囊线虫4号生理小种胁迫下存在响应，并在抗感品种中表达量存在显著差异。东农L-10、东农L-204和Kangxian2不但具有大豆胞囊线虫4号生理小种抗性，也具有大豆胞囊线虫3号生理小种抗性，所以推测Gm-PEBP4-1基因可能对大豆胞囊线虫3号生理小种存在响应。Klink等研究表明SCN在侵染大豆后8 d左右开始建立合胞体[22]，本研究中抗病品种和感病品种GmPEBP4-1基因表达量均在7 d达到最大值，表明该基因可能在大豆胞囊线虫大豆体内建立合胞体时发挥重要作用。

本研究初步确定GmPEBP4-1基因响应大豆胞囊线虫4号生理小种，预测GmPEBP4-1基因生物信息学功能，但GmPEBP4-1基因在大豆中是否提高SCN抗性以及具体功能有待进一步研究。本研究结果为进一步探究GmPEBP4-1基因功能及其参与大豆胞囊线虫病基因相关分子机制奠定理论依据。