LncRNA-SChLAP1在结直肠癌组织中高表达的预后评估意义

孙小艳 张晓艳

结直肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第四大主要原因[1]。尽管在外科手术和辅助化疗方面取得了进展，但仍有20%～25%的患者在治疗性手术后复发[2]。国际癌症控制联盟(UICC)的肿瘤淋巴结转移分期系统(TNM)是目前评估患者预后的最可靠指标[3]。然而，即使在 TNM 早期阶段，患者预后也存在差异，需要更可靠的标志物来提高癌症复发和患者生存的预测准确性。长链非编码RNA(lncRNA)是位于胞核或胞浆的一类长度大于200 nt的非编码RNA的总称，lncRNA 介导的生物学特征已被发现广泛存在于各种癌细胞演进进程中，其表达受发育调控，具有组织和细胞特异性，近年来已成为肿瘤分子生物学研究的热点。SChLAP1 是一种新型的lncRNA，Prensner等[4]研究认为SChLAP1在前列腺癌的一个亚型中高度过表达，参与了肿瘤细胞的侵袭和转移。最近，有研究者通过qRT-PCR检测到SChLAP1在膀胱癌中表达[5]，但在CRC的预后评估中的作用及其与生存率的关系尚不清楚。

1 材料和方法

1.1 临床资料

从 2007年—2014年在沈阳肿瘤医院和丹东第一医院病理与肿瘤组织库随机抽取 156 例CRC术后新鲜组织标本。对年龄、性别、肿瘤大小、TNM 分期、CEA 水平、无病生存期(DFS)、总生存期(OS)等资料进行了详细回顾。患者年龄在 31～76 岁之间，平均年龄51.6±2.3岁。男女比例为2.71∶1。根据美国癌症联合委员会第六届会议制定的肿瘤分期标准进行分期[6]。在 156 例 CRC 标本中，87 例为早期(Ⅰ～ⅡA)，69 例为晚期(ⅡB～Ⅳ)。所有患者在手术前均未接受过化疗和放疗。以43例癌旁结直肠组织为对照。

1.2 RNA 提取和 qRT-PCR

使用试剂盒(TaKaRa公司，日本)根据制造商的说明书提取组织样本的总RNA。通过逆转录酶引物合成第一链cDNA(TaKaRa公司，日本)和低聚糖(dT)。PCR反应都是在20 μL反应物中，以94℃变性4 min开始，然后进行PCR扩增23～36周期，94℃ 15 min和53～58℃ 30 s，引物退火，并引物在72℃延长1 min，在3%琼脂糖凝胶进行电泳[6]。用Champchemi专业图像分析系统(赛智公司，中国)和LANE 1D软件对蛋白条带进行量化。实时定量PCR是由Bio-Rad序列检测系统根据制造商的指示使用双链DNA-specific SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(TaKaRa公司，日本)重复三次，用2-ΔΔCt法计算待测样本mRNA相对表达量。SChLAP1引物：5′-CGGAGAGGATGGGCTCTGGCATT-3′，5′-AGGGACCCTTCAGGGTGGCTG-3′；GAPDH引物：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，5′-CCATGTAGT TGAGGTCAATGAAG-3′。

1.3 随访

所有患者随访5年时间，最终截止到2019年3月，89 名患者死亡，67名患者生存。总生存期(OS)是指从病人确认患病起至任何原因引起死亡的时间，无病生存期(DFS)是指随机化开始直到肿瘤复发或因各种原因出现死亡的时间。

1.4 统计分析

统计分析采用SPSS 19.0统计软件包(SPSS Inc.，美国)，CRC及癌旁组织中SChLAP1表达水平的比较用独立样本t检验，SChLAP1表达与临床病理学参数之间的关系比较用卡方检验和Fisher精确检验；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间生存曲线比较使用Log-rank检验；Cox风险回归模型分析OS和DFS的影响因素，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SChLAP1 在 CRC中表达情况

应用 qRT-PCR 检测 156 例 CRC 患者和43例癌旁结直肠组织SChLAP1 表达水平。结果显示，SChLAP1 在癌组织中表达高于癌旁组织(t=13.662，P<0.001)(图 1)。

图1 qRT-PCR检测SChLAP1在CRC和癌旁组织中的表达Figure 1 The expression of SChLAP1 in CRC and adjacent tissuesNote：The level of SChLAP1 mRNA in CRC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues.**P<0.01.

2.2 SChLAP1 表达与CRC临床病理参数的关系

以 SChLAP1 的中位表达水平(2.823)作为界值，将156例患者分为高、低两组。SChLAP1的高表达率与CRC分化程度(P=0.002)和TNM分期(P=0.006)有关，而与其它参数无关(表1)。

2.3 SChLAP1表达与CRC患者OS和DFS的关系

Kaplan-Meier分析156例CRC患者DFS和OS与SChLAP1 表达的关系，SChLAP1高表达患者DFS较低表达者明显降低(χ2=13.318，P<0.001)，而SChLAP1高表达患者OS也较低表达者明显降低(χ2=10.910，P<0.001)(图2)。

2.4 影响CRC生存期的独立预后风险因素分析

Cox风险回归模型分析发现，肿瘤大小(OS：P=0.047，DFS：P=0.020)、临床分期(OS：P<0.001，DFS：P<0.001)、浆膜侵犯(OS：P=0.007，DFS：P=0.005)与SChLAP1(OS：P=0.042，DFS：P=0.039)过表达都是CRC患者OS和DFS重要的独立预后风险因素(表2-3)。

表1 SchLAP1高表达与156例CRC的临床病理学参数的关系

图2 Kaplan-Meier分析156例CRC患者DFS和OS与SChLAP1 表达的关系Figure 2 The expression of SChLAP1 expression in 156 CRC patients with the DFS and OS by Kaplan-Meier analysisNote：A.The DFS in CRC patients with SChLAP1 high-expression(H)had lower than that in CRC patients with SChLAP1 low-expression(L)(χ2=13.318，P<0.001).B.The OS in CRC patients with SChLAP1 high-expression had lower than that in CRC patients with SChLAP1 low-expression(χ2=10.910，P<0.001).

表2 156例CRC患者OS影响因素的单因素和多因素分析影响

表3 156例CRC患者DFS影响因素的单因素和多因素分析影响

3 讨论

CRC是全世界第三常见的恶性肿瘤[7]，晚期肿瘤的转移和死亡率呈明显上升趋势[8]。揭示进展性癌症的发病机制可以解开结直肠癌发生发展的起因、探索肿瘤治疗的干预措施，并协助开发预防及治疗药物。尽管有了手术切除及放化疗等较为先进的治疗手段和技术，CRC患者5年生存率和生活质量仍未见明显改善，尤其是晚期CRC。寻找能够早期确诊的生物标志物、针对肿瘤细胞恶性进展相关基因实施的治疗措施是干预CRC肿瘤演进、降低复发和死亡率的关键[9]。

随着芯片和新一代测序高通量技术等的发展，lncRNA在转录组中的重要地位已明确，具有调节转录、翻译、细胞分化、基因表达调控、细胞周期调控、染色质修饰和细胞核-细胞质之间的运输等多种功能，在肿瘤形成、预后标志物作用、治疗模式风险预测等方面起着非常重要的作用[10]。因此，深入研究CRC相关lncRNAs的分子调控机制可以为早期诊断和预后评估提供有效的生物标志物和新的分子治疗靶点，为临床制定相应的治疗策略提供新思路。

lncRNA-SchLAP1被命名为与前列腺-1相关的第二个染色体基因座，也称为LINC00913，是一种新兴的 RNA 分子，是侵袭性疾病演进过程的重要介质，包括肿瘤侵袭和血源性传播[11]。SChLAP1 通过与 SWI/SNF 表观遗传复合物的拮抗作用进行转录调控，而 SWI/SNF 表观遗传复合物负责组蛋白在基因启动子上的定位。SWI/SNF 是许多癌症(包括前列腺癌)中明确定义的肿瘤抑制因子，通过基因突变或核心亚基的缺失而失活。另外，SWI/SNF复合物与已知的肿瘤抑制基因和癌基因产物如RB、BRCA1、c-MYC和MLL之间也直接发生作用。通过干扰 SWI/SNF 功能，SChLAP1 导致成百上千基因表达的改变，这可能促进整个转移级联，而不是通过单一的信号通路，潜在地增强早期去势抗性和死亡风险[12-15]。已有报道提出SWI/SNF核心元件BRG-1和催化亚单位BRMS1的缺陷可促进CRC的扩散，但目前尚不清楚这些蛋白是否与内源性 SWI/SNF 酶亚基共同作用或独立作用[16]。而SChLAP1已被发现在前列腺癌和膀胱癌中上调，在 CRC 中的确切作用尚不清楚。我们因此大胆预测SChLAP1也可能在CRC的演进中起到一定的作用而检测了 SChLAP1 的表达，发现 SChLAP1 在 156 个 CRC 组织中的表达高于 43个癌旁组织；SChLAP1 高表达与分化、临床分期显著相关；在生存方面，我们发现高表达 SChLAP1 的 CRC 患者比低表达 SChLAP1 的患者有更低的DFS和OS；最后，多因素生存分析表明，SChLAP1 高表达和临床分期、浆膜浸润、肿瘤大小同时成为 CRC 生存的独立风险因素，而临床分期、浆膜浸润、肿瘤大小是被公认具有预后评估意义的临床参数，说明SChLAP1对CRC的预后评估有一定的意义。

了解 SChLAP1 在 CRC 中的关键作用可能会导致一种新型诊断标记物的开发。然而，SChLAP1 调控 CRC 肿瘤迁移和侵袭的分子机制尚需进一步研究。由于本研究首次报道了 SChLAP1 在 CRC 中的生物学功能，因此需要在大量样本中进行进一步研究，并对其他可能的作用机制进行研究。