SKA1对肾细胞癌细胞增殖凋亡的影响及其分子机制研究

韩静 蒲艳 柳惠斌

有丝分裂过程中，染色体分裂异常是产生遗传不稳定性继而导致肿瘤发生发展的重要原因。纺锤体和动粒相关蛋白复合体亚基1(Spindle and kinetochore -associated complex subunit 1，SKA1)是动粒与微管稳定结合所必需的组成部分[1-2]，在有丝分裂过程中发挥关键作用[3]。多项研究显示[4-6]，SKA1参与了对肿瘤进程的调控，并在包括舌部腺样囊性癌、膀胱癌、肝癌等恶性肿瘤组织中异常高表达，表达水平与患者病理特征参数及临床转归显著相关。然而关于SKA1在肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)恶性进展中的调节功能及分子机制研究鲜有报道。本研究通过对SKA1在肾细胞癌中的生物学功能及下游调控蛋白的初步探索，为肾细胞癌的精准干预提供新的切入点，为临床基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人肾细胞癌细胞株786-O和ACHN购自中国科学院上海细胞库；TRIzol、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；cDNA逆转录试剂盒、SYBR green荧光定量试剂盒购自日本Takara公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)凋亡试剂盒购自美国BD公司；CCK-8试剂盒购自东仁化学科技有限公司。一抗包括：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、裂解的Caspase 3、裂解的Caspase 9及内参β-actin购自美国Abcam公司；二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 肾透明细胞癌组织样本

收集2016年1月—2018年9月于新疆医科大学附属肿瘤医院泌尿外科就诊的72例肾透明细胞癌患者手术切除的肿瘤组织及相应癌旁组织(距离癌组织3 cm以内)。患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗，排除伴发器质性或系统性疾病，如糖尿病、高血压等，及合并其他肿瘤者。其中男性67例，女性5例，年龄32～81岁，中位年龄54岁，≤54岁39例，>54岁33例。本研究已通过新疆医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准(K-2019004)，所有患者签署知情同意书。

1.3 数据资料整理与生存分析

从V18.0版(2019.7.8)癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库下载肾细胞癌不同病理亚型数据集中SKA1 mRNA的表达数据，及相对应的临床病理资料和预后资料，并利用Kaplan-Meier Plotter在线工具进行生存分析。数据库通过筛选分析临床资料相关数据，仅保留TCGA数据集中包含完整临床参数和生存资料的病例，样本SKA1 mRNA表达水平大于中位数，则定义为SKA1高表达，反之则定义为低表达。

1.4 细胞培养与慢病毒载体

人肾细胞癌细胞系786-O和ACHN用含10%胎牛血清的DMEM培养基，并置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。含有效SKA1基因干扰片段的慢病毒载体pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6由上海和元生物科技有限公司构建。根据SKA1 cDNA基因信息，设计2条SKA1 siRNA干扰序列：shSKA1-1：5′-GGAGATGAGATCATTGTAA-3′；shSKA1-2：5′-GGAACTCTGT-GAATCTCTT-3′；shNC无义序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。两条干扰片段的干扰效率均超过70%。实验中选择了干扰效率更佳的shSKA1-1(shSKA1)开展后续研究。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)

使用Trizol试剂提取组织和细胞总RNA，Type1510Multiskan GO酶标仪检测其纯度及浓度。PrimeScript RT酶将RNA逆转录成cDNA，使用ABI Prism7900 HT系统和SYBR green试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，引物序列见表1。

表1 SKA1和GAPDH的引物序列

1.6 CCK-8法检测细胞增殖

实验分为两组，取对数生长期的786-O及ACHN细胞，感染含SKA1的慢病毒载体shSKA1为实验组，感染携带无义序列的病毒载体为shNC对照组，MOI=10，采用含2 μg/mL嘌呤霉素的培养基进行培养。每组设置5个重复，分别在培养0 h、24 h、48 h、72 h和96 h检测细胞增殖情况。检测时每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃，5% CO2细胞培养箱避光培养3 h后，用酶标仪测定450 nm波长处的光密度值(OD值)，绘制细胞生长曲线。

1.7 克隆形成能力检测

为评估SKA1敲减后对RCC细胞的远期效应，采用克隆形成实验检测其作用。细胞消化重悬后计数，于6孔板中每孔接种2 000个细胞，各组设3个复孔。细胞在培养箱孵育2周后，弃上清，用0.1%结晶紫染色30 min，PBS冲洗三次，统计克隆形成数目，并比较各组克隆形成的差异。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期的786-O及ACHN细胞，感染含shSKA1或shNC的慢病毒载体。72 h后收集细胞沉淀。用500 μL的结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，在室温避光条件下孵育15 min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 差异基因的IPA生物信息学分析

为了探索与SKA1相关的下游信号分子，感染慢病毒的两组786-O细胞进行基因表达谱芯片检测(GeneChip primeview human)，利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)(http：//www.ingenuity.Com)在线平台分析差异基因相关的经典信号传导通路及生物学功能。

1.10 Western blot法分析蛋白表达

参照相关文献进行常规操作[7]， 以 β-actin作为内参蛋白(1∶5 000)。转染72 h后，收集shSKA1组和shNC组的肾细胞癌细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，在4℃1 300 rpm条件下离心15 min并收集上清液。采样BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后上样，电泳分离使用湿转法转膜。在4℃分别与一抗(1∶2 000)孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗涤后膜上滴加ECL化学发光底物曝光，用Bio-rad凝胶成像系统曝光并对图像进行分析。

1.11 统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件分析，计数资料采用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验、连续性校正χ2检验或Fisher精确检验。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验和配对样本t检验。两组以上独立样本比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t方法。CCK-8检测数据的分析采用重复测量方差分析及Bonferroni法。生存曲线采用Kaplan-Meier法进行生存分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SKA1表达水平与肾细胞癌患者临床病理学特征的关系

TCGA数据库中分别纳入具有完整病例资料的肾嫌色细胞癌(Kidney chromophobe cell carcinoma，KICH)、肾透明细胞癌(Kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)、肾乳头状细胞癌(Kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)病例数分别是45、432和228。分析表明SKA1 mRNA表达水平与KIRC和KIRP患者的T分期、N分期、M分期及AJCC分期有关(P<0.01)，而与KICH患者的临床病理特征无关(P>0.05)。不同病理亚型肾细胞癌患者的性别、年龄与SKA1 mRNA表达水平无关(P>0.05)(表2)。

2.2 SKA1表达水平与肾细胞癌患者预后的关系

根据TCGA数据库资料分析显示(图1)，SKA1在KICH、KIRC和KIRP中的表达水平明显高于正常肾组织(P<0.01)。Kaplan-Meier Plotter在线数据分析表明，SKA1表达越高，预后越差(P<0.001)。实时荧光定量聚合酶链反应实验结果显示(图2)，SKA1在KIRC组织中表达水平高于癌旁组织(1.07±1.28vs. 0.48±0.50，t=2.764，P=0.006)，与TCGA数据库分析结果相一致。

SKA1在KIRC中表达水平高于KICH和KIRP(t=-2.673，P=0.001；t=2.748，P=0.008)(图3)。SKA1高表达与患者生存期缩短有关，提示SKA1可能是肾癌的不良预后因素。

表2 不同病理亚型肾细胞癌组织中SKA1表达水平与临床病理特征的关系

图1 SKA1在肾细胞癌中的表达及与总生存期的相关性分析Figure 1 The expression of SKA1 and its correlation with overall survival time of renal cell carcinoma patientsNote：A.The expression of SKA1 in renal chromophobe cell carcinoma and normal tissues；B.The expression of SKA1 in renal clear cell carcinoma and normal tissues；C.The expression of SKA1 in renal papillary cell carcinoma and normal tissues；D.Relationship between the expression of SKA1 and prognosis of patients with renal chromophobe cell carcinoma；E.Relationship between the expression of SKA1 and prognosis of patients with renal clear cell carcinoma；F.Relationship between the expression of SKA1 and prognosis of patients with renal papillary cell carcinoma.

图3 不同肾细胞癌中SKA1 mRNA的表达水平Figure 3 The expression of SKA1 in different renal cell carcinoma tissuesNote：**P<0.01，when compared with the KIRC.

2.3 SKA1对细胞增殖、凋亡的影响

CCK-8实验结果表明，在786-O细胞和ACHN细胞中，shSKA1实验组细胞增殖速率较对照组(shNC)降低(F=48.459，P=0.002；F=69.403，P=0.001)(图4A)。同时，细胞的克隆形成能力明显降低，shSKA1/786-O细胞几乎不能形成肉眼可见的细胞克隆(图4B)。786-O/shSKA1与shNC组克隆数分别为(30.25±8.63)和(219.46±6.24)(t=-28.178，P<0.001)；ACHN/shSKA1与shNC组克隆数分别为(130.91±9.68)和(285.46±5.31)(t=-24.441，P<0.001)。流式细胞仪检测结果显示，SKA1被抑制后，细胞凋亡率显著增加(图4C)。786-O/shSKA1与shNC组凋亡率分别为(50.8±6.74)%和(1.6±1.09)%(t=12.542，P<0.001)；ACHN/shSKA1与shNC组凋亡率分别为(38.21±5.31)%和(7.50±3.06)%(t=8.959，P=0.001)。

2.4 功能与通路分析

通过IPA@分析差异基因在功能与信号通路中的富集情况。所有的疾病与功能使用-Log(P-value)值进行排序。结果表明，敲减SKA1表达后差异基因生物功能主要集中在细胞生长与增殖模块(图5A)。IPA@使用了Activation z-score算法，对下游调控子的激活或者抑制进行预测，发现肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)被预测为强烈激活(图5B)，而PI3K/Akt通路中信号分子被显著抑制(图5C)。

图5 敲减SKA1表达后差异基因IPA@功能网络分析Figure 5 Analysis of IPA@ functional network of differential genes after knocking down SKA1 expressionNote：A.Biological function enrichment analysis；B.TNF was predicted to be strongly activated；C.Signal pathway enrichment analysis.*P<0.05，** P<0.01，when compared with control group.

图4 干扰内源性SKA1表达水平对肾细胞癌细胞生物学功能的影响Figure 4 The effect of interference with endogenous SKA1 expression level on biological function of renal cell carcinoma cellsNote：A.Changes of cell proliferation ability；B.Changes in the ability of cell clone formation；C.Changes in apoptosis rate；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared with control group.

2.5 SKA1对增殖、凋亡相关蛋白的调控

蛋白质印迹实验结果显示(图6)，与对照组相比，SKA1干扰组中TNF-α蛋白及凋亡相关的分裂的Caspase 3和Caspase 9表达水平显著上升，而与细胞增殖相关的PI3K信号途径中磷酸化Akt和磷酸化mTOR的水平显著下调，提示SKA1表达沉默后可通过增加细胞中TNF-α表达量启动RCC细胞线粒体凋亡途径，同时抑制增殖相关的信号分子从而抑制肾细胞癌的恶性转化。

图6 干扰内源性SKA1表达对肾细胞癌细胞中相关蛋白的影响Figure 6 The effect of interference with endogenous SKA1 on proteins related to apoptosis and signal pathways in renal cell carcinoma cells

3 讨论

DNA转录和mRNA翻译是真核生物基因表达必不可少的过程。当真核生物的mRNA翻译失调，基因表达过程将会紊乱，导致细胞生长失控甚至触发肿瘤形成[8]。因此，靶向人类肿瘤中反常的翻译起始因子也许是一个潜在的靶向治疗策略。SKA1蛋白是SKA蛋白复合体的重要组成亚基，定位于染色体18q21.1，编码255个氨基酸，分子量约为30 kDa。SKA1蛋白是与有丝分裂密切相关的基因，是动粒结合微管蛋白必不可少的组成部分，其表达异常可导致纺锤体检测点发生缺陷，影响细胞周期调控和肿瘤的发生发展过程[6]。研究表明，SKA1在多种肿瘤中存在过度表达，并且其表达与肿瘤预后[9]、侵袭迁移[10]以及化疗耐药[11]密切相关。目前，SKA1与肾癌的相关研究日益受到关注。有报道显示，SKA1高表达于原发性和酪氨酸激酶抑制剂治疗失败的肾癌患者中，可作为肾癌潜在的预后标志物和治疗靶点[12-13]。为了明确SKA1在肾细胞癌中的表达水平，我们对TCGA数据库进行SKA1基因数据集的分析。结果表明SKA1在三种不同肾细胞癌亚型的癌组织与正常肾组织中的表达水平均有统计学差异，并与总生存期显著相关。进一步分析临床病理资料，发现SKA1表达水平与肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌的T分期、N分期、M分期及AJCC分期相关，提示SKA1在肾细胞癌内发挥癌基因的作用，可能通过影响有丝分裂，进而促进肿瘤细胞恶性增殖，推测其作为肾细胞癌新的临床预后指标。

细胞生物学实验结果显示，在RCC细胞786-O和ACHN中转染SKA1干扰慢病毒能显著抑制细胞增殖，使细胞克隆形成能力受限，同时能够促进肾细胞癌细胞的凋亡，证实了SKA1的持续过表达对于肾细胞癌细胞系生物学功能的维持至关重要。为进一步探索其潜在的分子机制，我们利用IPA@生物信息学平台筛选差异蛋白涉及的主要生物功能及信号通路。研究发现差异基因显著富集在细胞生长与增殖模块，肿瘤坏死因子被强烈激活，而PI3K/Akt/mTOR信号分子的磷酸化水平被抑制。

TNF-α通过与靶细胞膜上肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)结合，实现其细胞毒性、抗病毒、免疫调节等生物学功能。当TNF-α三聚体与靶细胞膜上TNFR1的胞外区结合，可引发不同的下游信号通路，诱导经典和非经典Caspase依赖型细胞凋亡[14-15]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，其组成性活化与肿瘤的发生、发展密切相关[16-17]。恶性肿瘤中，由于此信号转导通路过度激活可在转录和翻译水平上诱导肿瘤细胞的失控性增殖，还可通过调控多个凋亡相关因子使凋亡途径受阻，引发细胞恶性增殖[18-19]。

为进一步验证在线富集分析结果，本研究利用Western blot法检测细胞增殖、凋亡相关蛋白表达水平，结果表明，抑制内源性SKA1表达可导致TNF-α特异性激活，从而使凋亡信号通路发生级联反应促进肿瘤细胞凋亡。同时，慢病毒介导的SKA1沉默还可通过降低Akt/Ser473和mTOR/Ser2448位点的磷酸化水平，阻遏肿瘤细胞异常增殖而发挥抗癌作用。然而，本研究只对SKA1在肾细胞癌中的功能及下游调控分子进行了初步探讨，后续还需从分子机制上进行深入研究。

综上所述，我们通过挖掘生物信息数据库发现SKA1在肾细胞癌组织中高表达，并与预后相关。细胞生物学实验结果证实SKA1过表达能促进肿瘤恶性增殖和抑制肿瘤细胞凋亡，表明SKA1可能是肾细胞癌发生发展过程中的重要靶标，有望成为潜在标志分子辅助判断肾细胞癌预后复发。