99mTc-HYNIC-MPG在体非小细胞肺癌分子分型研究

闫 侯利芳 李任飞 闫鹏 王月东 郑玉婷

肺癌发病率和死亡率均较高，居恶性肿瘤首位[1]，80%属于非小细胞肺癌(NSCLC)[2]。常规手术、放疗和化疗疗效欠佳，五年存活率低[3]。靶向治疗是最有希望治愈肺癌的手段[4]，目前常用的靶向药物是小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)[5]，如吉非替尼、厄洛替尼和阿帕替尼等，其靶点是表皮生长因子受体(EGFR)，EGFR能够调节细胞生长、增殖、分化、血管生成和转移[6]。尽管靶向药物对EGFR突变的患者疗效显著[7]，但是会有60%以上的患者发生二次突变而产生耐药[8]。因此，检测EGFR是否突变是预测EGFR-TKI靶向治疗疗效的关键。直接基因测序是检测EGFR突变的金标准[9]，但是需要反复穿刺取材，检测时间长，所以限制了其临床应用。因此，迫切需要实时、动态及在体检测EGFR突变情况指导临床肺癌靶向治疗。

分子影像能够在体评估EGFR是否突变及靶向治疗过程中EGFR再次发生突变。18F-PEG6-IPQA、11C-Erlotinib、11C-PD153035和11C-Geftinib等探针已合成并用于评估EGFR突变情况[10-11]。本研究先前合成PD153035的类似物MPG并成功合成探针99mTc-HYNIC-MPG。在此进一步探讨了99mTc-HYNIC-MPG探针活体SPECT分子成像。

1 材料和方法

1.1 合成99Tc-HYNIC-MPG探针

如文献描述[12]，最优条件合成，0.5 mL EDDA溶液(10 mg/mL)，10 μL HYNIC-MPG(3 mg/mL)，10 μL SnCl2(0.2 mg/mL)和Tricine 20 mg，在氮气保护的情况下，100℃加热10 min，然后用C18分离纯化柱子纯化。使用纸层析法测定放化标记率。合成99Tc-HYNIC-MPG的放射化学纯度为>98%。

1.2 细胞培养

购于ATCC的四种人类非小细胞肺癌细胞系：实验组PC9细胞系(EGFR 19外显子E746-A750缺失)，对照组H1975细胞系(EGFR L858R/T790M双突变)，对照组H358细胞系(EGFR野生型)和对照组H520细胞系(EGFR表达阴性)。细胞培养液为RPMI-1640和胎牛血清(9∶1比例)，其中PC9细胞系需要使用DMEM培养，37℃ 5%CO2培养箱内培养。细胞传代、复苏及冻存的过程中严格执行无菌操作，防止细胞污染。

1.3 细胞摄取、释放和阻断实验

实验前12 h选取生长状态良好的四种细胞系12孔培养板铺板，每孔加入5×105个细胞，每孔加入1.0 μL Ci99Tc-HYNIC-MPG探针后，放置37℃细胞孵育箱孵育。于15、30、60和120 min时间点去除液体，1 mL冷的PBS冲洗两次，冲洗液使用γ-counter(PerkinElmer 2480)每分钟计数(CPM)为Cout，然后加入200 μL 0.1N的NAOH，使用200 μL冷PBS溶液冲洗两次，液体保留，γ-counter计数Cin，细胞摄取计算公式=Cin/(Cin+Cout)。同理，细胞加入99Tc-HYNIC-MPG探针孵育2 h后行细胞释放实验。实验前1 h在PC9细胞中加入PD153035(100 μM)，剩余步骤与摄取和释放实验一致。

1.4 建立荷瘤鼠模型

使用标准实验用裸鼠，购于国家实验动物种子中心上海分中心，雌性BALB/c裸鼠48只体重(20.0±0.5)g，年龄为6周(动物系)，所有的动物实验均获得哈尔滨医科大学动物伦理委员会审批，有专业人员提供喂养和保洁，有严格的实验操作流程。建立四种细胞系荷瘤鼠模型，生长状态良好的细胞消化，计数5×106个细胞，使用1 mL胰岛素注射器抽吸细胞悬液注入裸鼠右肩。使用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，体积公式=(长径×短径2)/2，待体积达到200 mm3时可行实验。

1.5 SPECT扫描

使用临床SPECT扫描仪。四组荷瘤裸鼠均经尾静脉注射7.4MBq(100 μL含200 μCi)探针99Tc-HYNIC-MPG，使用小动物麻醉机2%异氟烷麻醉(每组3～4只荷瘤鼠)，于1 h、2 h、4 h和6 h时间点成像。成像条件：变焦倍数为1，静态成像5 min，数据储存为1 024×1 024，能量窗口为126～154 keV，核素为99Tc。阻断实验是在SPECT成像前1 h荷PC9肿瘤鼠模型尾静脉注射100 mg/kg的PD153035，其余步骤如前，在感兴趣区域计算出肿瘤/肌肉比值。

1.6 生物分布实验

SPECT成像后，处死实验裸鼠，立即采集大脑、心脏、肺、肝、肿瘤、骨、肾、胃、肠、血、脾、皮肤和肌肉等组织。伽玛计数器(PerkinElmer)测量样品放射性计数以及测量样品湿重，在校正了所有测量值的衰减后，放射性以注射剂量的百分比表示每克(% ID/g)。

1.7 统计分析

应用SPSS 16.0统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，重复测量设计资料的分析采用重复测量方差分析，两组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞摄取、释放和阻断试验

PC9细胞系对99mTc-HYNIC-MPG的摄取明显高于H358、H520和H1975三种细胞系。在2 h时，PC9细胞中探针摄取率达到最高水平(22.73±0.63)%，明显高于H1975细胞摄取率(6.14±0.43)%(P=0.002)，H358细胞摄取率(3.39±0.37)%(P=0.0007)和H520细胞摄取率(4.17±0.25)%(P=0.0009)(图1A)。在细胞释放实验中，PC9细胞2 h时探针摄取率为(6.16±0.28)%，高于H1975(2.03±0.61%，P=0.04)，H358(1.23±0.30%，P=0.03)和H520(1.63±0.05%，P=0.04)H1975、H358和H520细胞(图1B)。而且，PC9细胞对99mTc-HYNIC-MPG的高摄取可被100 μM的PD153035阻断，其吸收比从(22.73±0.63)%下降到(1.90±0.06)%(P<0.0001)，而且释放实验也能证实PD153035的阻断作用(图1C-D)。

2.2 SPECT成像

PC9细胞系荷瘤鼠的肿瘤对99mTc-HYNIC-MPG探针摄取率高而且在所有时间点上都比另外三种细胞系荷瘤鼠的肿瘤对探针摄取率要高。在6 h的时间点上PC9组T/M比值(5.47±0.37)高于H1975组(2.45±0.32，P=0.025)、H358组(2.35±0.40，P=0.019)和H520组(1.72±0.28，P=0.008)(图2)。PC9动物模型对99mTc-HYNIC-MPG摄取被100 mg/kg的PD153035阻断，T/M比降至2.51±0.30(P=0.009)(图3)，说明99mTc-HYNIC-MPG探针只靶向19外显子缺失的EGFR突变。

图2 四种不同细胞系动物模型对99mTc-HYNIC-MPG探针的摄取情况Figure 2 The imaging of 99mTc-HYNIC-MPG probes taken in xenografts from PC9，H1975，H358 and H520 cells in BABL/c nude miceNote：Xenografts from PC9 cells were obvious more uptaken 99mTc-HYNIC-MPG probes in nude mice.Arrows for different tumor cell lines.

图3 PC9动物模型的在体阻断实验Figure 3 The imaging of blocking 99mTc-HYNIC-MPG in xenografts from PC9 cells in BABL/c nude miceNote：A.The imaging of 99mTc-HYNIC-MPG uptake in xenografts from PC9 cells；B.The imaging of blocked uptaken 99mTc-HYNIC-MPG by injected PD153035(100 mg/kg).Arrows show xenografts.**P<0.01，when compared with before treatment.

图1 细胞摄取、释放及阻断实验Figure 1 The cellular uptake，efflux and blocking 99mTc-HYNIC-MPG in H358，H520，H1975 and PC9 cellsNote：A.The highest cellular uptake ratio of 99mTc-HYNIC-MPG was in EGFR-mutated PC9 cells(22.73±0.63)%，following H1975 cells，H358 cells and H520 cells.**P<0.01，when compared with the PC9 group；B.The cellular efflux of 99mTc-HYNIC-MPG in H358，H520，H1975 and PC9 cells. **P<0.05，when compared with the PC9 group；C.The cellular uptake of 99mTc-HYNIC-MPG after mutated EGFR binding to 99mTc-HYNIC-MPG was blocked with PD153035(100 μmol/L)in PC9 cells.**P<0.001，when compared with the PC9-MPG group；D.The cellular efflux of 99mTc-HYNIC-MPG after blocking in PC9 cells，**P<0.01，when compared with the PC9-MPG group.

2.3 生物分布实验

99mTc-HYNIC-MPG探针成像后，生物分布实验证实2 h时PC9肿瘤对99mTc-HYNIC-MPG探针摄取率为(7.20±0.27)%ID/g，高于H1975(2.35±0.03%ID/g，P=0.008)、H358(2.47±0.01%ID/g，P=0.009)和H520(1.93±0.01%ID/g，P=0.007)(图4A)。生物分布实验证实PC9荷瘤鼠模型对99mTc-HYNIC-MPG探针的特异性。100 mg/kg PD153035阻断时，PC9摄取从(7.20±0.27)% ID/g下降至(2.67±0.27)% ID/g，P=0.009)(图4B)。这一结果与SPECT成像一致。所有荷瘤鼠大脑的摄取均很低，表明99mTc-HYNIC-MPG不能通过血脑屏障。

图4 四种细胞系荷瘤鼠的生物分布实验及阻断实验Figure 4 The biological distribution and blocking 99mTc-HYNIC-MPG in xenografts from PC9，H1975，H358 and H520 cells in BABL/c nude miceNote：A.The biological distribution of 99mTc-HYNIC-MPG in main organs was observed at 2 h time point，the uptake of 99mTc-HYNIC-MPG in xenografts from PC9 cells reached(7.20±0.27)% ID/g 2 h through the injection of tail vein.**P<0.01，when compared with the PC9 groups；B.The blocking 99mTc-HYNIC-MPG probes by injected PD153035(100 mg/kg).**P<0.01，when compared with the before treatment.

3 讨论

精准判定肿瘤中EGFR突变情况可以准确选择靶向治疗的患者，同时可以设计更有效的治疗方案。这就需要检测患者肿瘤内EGFR突变状态，其金标准是荧光原位杂交和免疫组织化学分析[13]。然而，其具有巨大局限性：首先，穿刺活检取材分析EGFR不能反映肿瘤整体的异质性[14]。二是反复穿刺活检会造成患者心理和生理上的伤害[15]。相比之下，分子成像能够在体、实时、动态监测EGFR突变情况并克服了上述局限性。大量分子探针研究用于监测EGFR突变情况，如18F-geftinib、11C-PD153035和11C-geftinib[16-17]，但是18F和11C的半衰期分别是110 min和20.34 min，半衰期短，而且需要加速器合成，此外上述探针合成条件复杂，昂贵，限制了临床的广泛应用[18]，大多数上述示踪剂亲脂性太强而不能迅速从体内清除。99mTc半衰期6.02 h，能量1400 kev，可以通过钼锝发生器即可获得，各地二级临床医院均可使用。

于金明院士的研究证明PD153035能够特异性结合19外显子缺失EGFR突变(PC9细胞系)。PD153035的分子成像研究主要是通过18F或者11C标记[19]，而且PD153035水溶性较差，细胞毒性高，不适合临床推广应用。我们根据喹唑啉衍生物的结构设计并合成了MPG，在该分子中，PEG官能团在7位连接至喹唑啉环以增加亲水性。99Tc-HYNIC-MPG可以通过一步合成法轻松制备。本研究使用四种细胞系H358(EGFR野生型)、H520(EGFR阴性)、H1975(EGFR T790M/L858R二次突变)和PC9(EGFR 19 E746-A750)，PC9细胞系是EGFR 19 E746-A750缺失，能够指导特异性蛋白表达，从而改变空间构象，能够特异的与MPG和PD153035结合，而其他三种细胞系无此特异性蛋白的表达，因此不能与探针特异性结合。体外实验表明，PC9细胞系与EGFR阴性或EGFR野生型细胞相比，99Tc-HYNIC-MPG积聚明显更高，并且PD153035可以阻断PC9细胞系对探针的摄取。PC9细胞系构建的肿瘤最高摄取为(7.20±0.27)%ID/g，但是肝脏对99Tc-HYNIC-MPG探针的摄取也高，是由于小分子酪氨酸激酶药物主要是通过肝脏代谢的，此外肾脏也代谢一部分，尿液中的探针含量也很高。99Tc-HYNIC-MPG不能通过血脑屏障能够对脑部组织起到很好的保护作用。具体的99Tc-HYNIC-MPG探针与EGFR 19 E746-A750缺失蛋白相结合的分子机制和分子线路图尚不清楚仍需进一步的研究。

本实验研究仍有一些不足之处，钼锝发生器生产99mTc，溶液中会有一些99Mo以及其他核素，放射纯度没有达到理想的丰度。使用99mTc标记探针时肝脏由于有Kupffer细胞等吞噬系统能够将游离的放射性核素吞噬到肝脏，增加肝脏的放射性剂量和背景噪声。同时99mTc-HYNIC-MPG合成后应进一步纯化，分离出未被标记的MPG，这样就能避免未标记的MPG抢占突变EGFR的ATP结合域，从而降低PC9细胞系肿瘤对99mTc-HYNIC-MPG探针的摄取，尤其是细胞水平的实验因其所需剂量甚小，所以影响更大。从本质上讲SPECT是一种定性的成像设备，只能半定量进行研究，因此99mTc-HYNIC-MPG探针活体成像能够对成像动物的具体器官如肝脏、肺脏及肿瘤等进行定量化分析，只能通过生物分布实验和体外实验进行验证，但其不能完全准确的反映活体的动态信息。在本研究的基础上，将使用PET/CT成像进一步研究MPG的相关性质。最后，小型动物SPECT成像仪器设备可以明显提高图像质量。

综上所述，99Tc-HYNIC-MPG探针SPECT成像能够特异性识别EGFR外显子19缺失突变，可用于筛选EGFR是否发生突变，是否适合靶向治疗，及有望用于监测临床靶向治疗的疗效，临床应用前景广阔。