LncRNAs作为ceRNAs在肺癌中的研究进展

程月 张明岩 张文博 综述 徐晖 审校

据统计，肺癌在全球范围内的发病率较高，并且已成为癌症死亡的主要原因[1]。肺癌的早期诊断比较难，往往发现时已属中晚期，且易发生血流转移，失去手术治疗的机会，而大多数的非小细胞肺癌对化疗的敏感性较低，肺癌的临床治疗已成为一大难题。因此阐明肺癌发生的分子机制对于提高肺癌患者生存率、改善患者的生存水平至关重要。

lncRNAs长度在200 bp以上，区别于20 bp左右的miRNAs，蛋白编码能力有限，曾被认为是RNAs中的暗物质，后来才发现这类RNAs具有调节转录和转录后基因表达水平的作用。lncRNAs的功能和它们的亚细胞定位相关。其中有些lncRNAs定位于胞浆，除了能干扰蛋白质翻译后修饰、造成异常的信号转导以外，还能通过ceRNAs等多种机制影响胞浆中mRNAs转录后水平表达[2]。已有研究表明lncRNAs通过ceRNAs机制在肺癌的发生发展中起重要作用，例如，DANCR作为ceRNA竞争结合miR-496，激活mTOR通路，促进肺腺癌发生发展[3]，DANCR还可能是肺癌诊疗中的潜在生物标志物之一[4]。因此阐明lncRNAs在肺癌中的作用机制对于寻找新的诊断标志物以确定治疗靶点、评价预后和改善化疗方案有重要意义。

1 lncRNAs作为ceRNAs的调控机制

Salmena等[5]的假说提出，lncRNA可作为ceRNA竞争性结合相同的miRNA，降解靶基因的mRNA。即在转录后水平，同时lncRNA和miRNA富集的情况下，lncRNA 中miRNA反应元件(microRNAs response elements，MREs)通过与mRNA竞争结合miRNA来调节下游mRNA表达(图1)，调节细胞功能。MREs作为RNA编码的信使，在ceRNA机制中起重要作用，由于结合miRNA相同位点的lncRNA上各MREs特异的核酸序列不同，同时lncRNA上的每个MRE对同一miRNA功能的作用强弱不一样，因此不同的MREs对miRNA的抑制程度也存在差异。

图1 竞争性内源RNA调控机制Figure 1 Regulatory mechanism of competitive endogenous RNA

2 lncRNAs作为ceRNAs在肺癌中的研究

2.1 lncRNAs作为ceRNAs调控肺癌细胞增殖

2.1.1 ZNFX1反义RNA1(ZNFX1 antisense RNA1，ZFAS1) lncRNA ZFAS1位于染色体20q13.13，Tomasz等[6]发现在头颈鳞状细胞癌中，ZFAS1具有癌基因特性；能调节上皮-间充质转化与癌细胞转移。Zeng等[7]发现ZFAS1在肺癌组织和细胞中表达上调，且具有miR-150-5p结合位点，同时miR-150-5p具有高迁移族AT-hook2(High-mobility group AT‐hook 2，HMGA2)结合位点。通过功能缺失研究发现，在肺癌A549和H1299细胞中，敲除ZFAS1后miR-150-5p表达升高，HMGA2表达降低，细胞增殖降低，而敲减miR-150-5p和过表达HMGA2能部分逆转这一作用。表明ZFAS1能通过竞争结合miR-150-5p，上调HMGA2的表达，从而促进非小细胞肺癌细胞的增殖。

2.1.2 长链基因间非编码RNA467(long intergenic non-protein coding RNA 467，linc00467) lncRNA linc00467位于染色体1q32.3，长度797bp，是一种新型lncRNA。Ding等[8]发现linc00467在肺腺癌组织中表达升高，且其表达量可能与患者的预后相关。Cyclin D1是由CCND1基因编码，可通过参与D-CDK4/6-RB通路促进细胞周期从G1期过渡到S期，促进肺腺癌细胞A549和H1299的增殖[9]。通过功能缺失研究发现，在这两类细胞中敲减linc00467，CCND1的表达降低。提示linc00467通过调节CCND1表达影响细胞周期。进一步研究发现miR-20b-5p过表达会降低CCND1蛋白水平，同时miR-20b-5p拥有linc00467或CCND1的结合位点，表明linc00467通过竞争结合miR-20b-5p调控靶基因CCND1的表达，从而调控肺腺癌细胞增殖[8]。除此之外，Chang等[10]还发现linc00467能海绵吸附miR-4779和miR-7978，通过ceRNAs机制促进肺腺癌细胞增殖，同时增强其干细胞活性。

2.1.3 肌动蛋白丝相关蛋白1反义RNA1(AFAP1 antisense RNA 1，AFAP1-AS1) lncRNA AFAP1-AS1位于染色体4p16.1，长度6 810 bp。Huang等[11]发现AFAP1-AS1在肺癌组织和细胞中高表达。Zhuang等[12]研究发现，下调其表达会抑制肺腺癌细胞生长。生物信息学分析表明miR-139-5p具有AFAP1-AS1结合位点，在肺腺癌A549和SPCA-1细胞中，干扰AFAP1-AS1表达后miR-139-5p表达上调，这表明在非小细胞肺癌细胞中两者表达呈负相关。敲减AFAP1-AS1或过表达miR-139-5p都会使这两类细胞增殖受到抑制，以上表明AFAP1-AS1可竞争结合miR-139-5p促进非小细胞肺癌细胞增殖。同时他们还发现AFAP1-AS1能通过竞争结合miR-139-5p调节RRM2影响非小细胞肺癌细胞对DDP 和5-FU的耐药性。

2.2 lncRNAs作为ceRNAs调控肺癌细胞凋亡

2.2.1 淋巴细胞白血病缺失基因2(Deleted in lymphocytic leukaemia 2，DLEU2) lncRNA DLEU2位于染色体13q14.2，Zhou等[13]发现DLEU2在非小细胞肺癌患者组织和细胞中高表达，下调DLEU2表达能促进肺腺癌细胞LLC凋亡。Liang等[14]发现血浆miR-30a-5p可作为肺癌早期无创诊断和预后生物标志物。随着进一步研究发现，在这两类细胞中，下调DLEU2能显著升高miR-30c-5p表达水平，通过双荧光素酶报告系统实验，证明miR-30c-5p是DLEU2的靶基因，且对其起负调控作用，表明DLEU2可作为miR-30c-5p的ceRNA。同时在这两类细胞中，DLEU2上调能升高SOX9蛋白水平，而上调miR-30c-5p表达能逆转这一作用[13]。因此，DLEU2通过竞争结合miR-30c-5p，上调SOX9表达，从而抑制非小细胞肺癌癌细胞凋亡。

2.2.2 类赖氨酸氧化酶1的反义RNA1(LOXL1 antisense RNA 1，LOXL1-AS1) lncRNA LOXL1-AS1位于染色体15q24.1，在细胞应激反应中起重要作用，且和剥脱综合征的病程进展相关[15]。Li等[16]发现LOXL1-AS1在肺腺癌组织和细胞中表达上调、且抑制肺腺癌细胞A549和SPCA-1细胞凋亡。miR-423-5p在肺腺癌细胞A549和SPCA-1中相对于在BEAS‐2B细胞中表达下降，且敲减LOXL1-AS1会增加其表达。荧光素酶实验显示miR-423-5p在LOXL1-AS1有两个结合位点，RNA结合蛋白免疫沉淀实验表明两者均显著富集于Ago2抗体。因此可以得出在肺腺癌中LOXL1-AS1可竞争结合miR-423-5p。同时也发现成髓细胞瘤转录因子第2亚型(MYB proto-oncogene like 2，MYBL2)是miR-423-5p的靶向位点，且由LOXL1-AS1调节。因此可以得出，LOXL1-AS1通过竞争结合miR-423-5p，调控MYBL2的表达，进而调节肺腺癌癌症进展。

2.2.3 长链基因间非编码RNA857(long intergenic non-protein coding RNA 857，linc00857) lncRNA linc00857位于染色体10q22.3，长度2 171 bp。Wang等[17]发现linc00857在肺腺癌中表达上调。进一步研究发现，敲减linc00857会促进肺腺癌细胞凋亡。下调非小细胞肺癌细胞H1229和H838中linc00857表达后miR-1179表达明显增加。双荧光素酶报告系统实验发现，linc00857能结合miR-1179[18]。研究表明，精子相关抗原5(Sperm-associated antigen 5，SPAG5)过表达与肺腺癌预后不良相关[19]。而且敲减linc00857抑制SPAG5转录和翻译水平。因此，linc00857通过竞争结合miR-1179，调控SPAG5表达，从而影响肺腺癌细胞凋亡，调节肺腺癌癌症进展，且有望成为肺腺癌治疗靶点[18]。

2.3 lncRNAs作为ceRNAs调控肺癌细胞迁移与侵袭

2.3.1 FOXF1相邻非编码发育调控RNA(FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA，FENDRR) lncRNA FENDRR位于染色体16q24.1。同源异型盒转录反义RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)通过结合多梳抑制复合物2(Poly-comb repressive complexe 2，PRC2)调节癌基因或抑癌基因，而FENDRR能结合PRC2[20-21]，于是Xu等[22]通过类比分析得出FENDRR可能也与癌症发生相关。

Zhang等[23]发现FENDRR表达水平与非小细胞肺癌预后相关，且其过表达抑制非小细胞肺癌细胞侵袭。通过在线生物信息学分析得出，miR-761含有一个以上FENDRR的结合位点，进一步研究发现，在FENDRR过表达的非小细胞肺癌细胞中miR-761表达受到抑制，且双荧光素酶报告系统实验表明两者直接相关，由此得出FENDRR可作为miR-761的ceRNA发挥作用。Yan等[24]发现miR-761能以其3′-UTR与金属蛋白酶组织抑制剂2(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP2)mRNA结合，使TIMP2转录后水平表达减少。Zhang等[25]发现，加入miR-761抑制物会抑制非小细胞肺癌细胞侵袭，而下调TIMP2会逆转这一作用。由此可得出，FENDRR通过竞争结合miR-761，上调TIMP2表达，从而抑制非小细胞肺癌细胞侵袭。

2.3.2 HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR) lncRNA HOTAIR位于染色体12q13.13。研究发现敲减HOTAIR抑制肺癌细胞侵袭[26]。Chen等[27]通过生物信息学分析发现，HOTAIR与miR-217有相同的结合位点，双荧光素酶报告系统实验表明，HOTAIR可竞争结合miR-217，进而调控肺癌细胞侵袭。在线分析得出miR-217与腊肠犬同系物1(Dachshund homolog 1，DACH1)有互补序列，双荧光素酶报告系统实验显示miR-217能降低DACH1的荧光素酶活性。除此之外，过表达miR-217显著抑制肺腺癌细胞H1299和A549的侵袭，而这一作用能被DACH1过表达所逆转。因此，在非小细胞肺癌中HOTAIR通过竞争结合miR-217，调控DACH1表达，进而调节细胞侵袭，可能为非小细胞肺癌提供治疗靶点。此外HOTAIR还能通过上调miR-613影响非小细胞肺癌的肿瘤发生，但对其下游mRNA的研究还不是很清楚[28]。

2.3.3 核旁斑装配转录本1(Nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1) lncRNA NEAT1位于染色体11q13.1，包含2个亚基，NEAT1_1(3.7 kb)和NEAT1_2(23 kb)，是核旁斑的重要组成结构，在应激反应和细胞分化中起重要作用[29-32]。Wu等[33]发现NEAT1在非小细胞肺癌细胞中表达显著增加，且其高表达促进肺癌细胞A549和H460迁移，而加入miR-98-5p类似物能逆转这一作用；miR-98-5p在非小细胞肺癌细胞中表达减少，且miR-98-5p类似物抑制这两类细胞迁移。有研究表明，miR-98-5p能通过结合整联蛋白β3的3′-UTR抑制非小细胞肺癌细胞迁移[34]。Wu等[33]还发现miR-98-5p能直接靶向结合NEAT1，这些结果表明NEAT1可作为miR-98-5p的ceRNA影响非小细胞肺癌细胞迁移。此外，丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK6)与miR-98-5p有相同的结合位点且直接相关。因此NEAT1通过竞争结合miR-98-5p，调控MAPK6表达而在肺癌细胞的迁移中起重要作用。

2.3.4 肺腺癌相关转录本1(Lung adenocarcinoma associated transcript 1 ，LUADT1) LncRNA LUADT1位于染色体6q24.3，长度453 bp。lncRNAs作为ceRNAs调控肺癌细胞迁移与侵袭不仅发生在非小细胞肺癌中，在小细胞肺癌中也同样存在。Wang等[35]发现在小细胞肺癌组织中LUADT1表达显著增加，miR-15a-3p在小细胞肺癌组织中表达减少。生物信息学分析发现LUADT1可能能与miR-15a-3p结合。进一步研究发现，小细胞肺癌细胞SHP-77中，LUADT1能通过竞争结合miR-15a-3p，上调Twist1表达，从而促进小细胞肺癌细胞迁移与侵袭。

3 小结与展望

随着高通量测序技术的发展，如紫外交联免疫沉淀结合高通量测序，光活性增强的核糖核苷交联和免疫共沉淀，更多在肺癌中通过ceRNAs机制起调节作用的lncRNAs将被筛选出来，丰富ceRNAs假说，进一步探索lncRNAs在肺癌发生发展中的作用，使lncRNAs作为肺癌的诊断标记物和潜在的治疗靶点而发挥重要的临床价值。本综述列出了一些通过ceRNAs机制在肺癌中形成调控网络的lncRNAs，希望对未来lncRNAs通过ceRNAs机制在肺癌中的研究有帮助。