lncRNA BLACAT1靶向LEMD1促进结直肠癌细胞的增殖和转移

董满库 姜福全 林海冠 孙晓敏 刘景欣 胡刚 杨建武

结直肠癌是临床上常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病原因与家族遗传、饮食习惯和生活习惯等有关[1]。在我国及世界范围，结直肠癌的发病率在所有癌症中位居第三[2-3]，其死亡率位居第四或第五[4]。深入研究结直肠癌患病机制，寻找药物作用新型靶点，对于治疗结直肠癌患者和预后均有重要的意义。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200 nt非编码蛋白的RNA[5]。近年来的研究结果表明，lncRNA通过表观遗传的方式参与细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学过程，与许多疾病的发生发展密切相关[6-7]。目前，检测出与结直肠癌有关的lncRNA主要有HT19、HOTAIR、MALAT1及BLACAT1等[5]。lncRNA BLACAT1(Bladder cancer associated transcript 1)是一种调控基因功能的lncRNA，2017年首次在研究中发现其在膀胱癌、胃癌以及宫颈癌中高表达[8]，敲低lncRNA BLACAT1能够降低星型细胞瘤的增殖和迁移能力[9]。在非小细胞肺癌组织中发现lncRNA BLACAT1异常高表达，并且与疾病分型相关[10]。研究发现，lncRNA BLACAT1高表达与结直肠癌分期及不良预后相关[11]，目前没有其调控结直肠癌细胞增殖及转移机制的相关研究报道。本研究主要选择几种结直肠癌细胞系SW620、SW480、HT-29、LoVo、HCT116，检测各细胞系lncRNA BLACAT1的转录水平，筛选细胞系研究lncRNA BLACAT1对靶基因转录和蛋白表达的影响，以及调控细胞增殖和侵袭的过程。

1 材料和方法

1.1 材料

选取2018年6月30日—2019年6月30日战略支援部队特色医学中心普通外科10例结直肠癌手术患者的癌组织和癌旁组织；人结直肠癌细胞系SW620、SW480、HT-29、LoVo、HCT116，人正常结直肠上皮细胞FHC(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；McCoy′s 5A培养基、F12K培养基及DMEM/F12(Sigma公司)；L-15培养基和胎牛血清(Gibco公司)；HEPES、霍乱毒素、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、人重组EGF(Sigma公司)；CCK-8试剂盒(日本东仁化学公司)；lncRNA BLACAT1、LEMD1、CARS2、BAMBI、TCF12的引物合成(北京博迈德基因技术有限公司)；cDNA合成试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega)；SYBR Green染料(北京百奥莱博科技有限公司)；si-BLACAT1、si-LEMD1、si-NC(广州锐博生物科技公司)；p-BLACAT1构建(上海和元生物技术股份有限公司)；LipofectAMINE 2000(Invitrogen公司)；LEMD1抗体、GABDH抗体和HRP标记的二抗(Abcam公司)。

1.2 lncRNA BLACAT1在结直肠癌组织中的表达分析与细胞培养

通过starBase平台分析TCGA数据库中471例结直肠癌组织样本和41例癌旁组织样本lncRNA BLACAT1的表达差异(2020年3月)；同时，选取10例患者的肿瘤组织和癌旁组织进行RNA提取和qPCR检测，比较lncRNA BLACAT1的表达差异。

人结直肠癌细胞系SW620、SW480、HT-29、LoVo、HCT116及人正常结直肠上皮细胞FHC分别使用L-15、L-15、F12K、McCoy′s 5A、McCoy′s 5A、DMEM/F12培养基，与胎牛血清按9：1体积比混合配置完全培养基，在含5% CO2培养箱中培养。

1.3 lncRNA BLACAT1在结直肠癌细胞系中的表达分析

用TRIzol法分别提取五种结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞的总RNA，取2 μg样品按照反转录试剂盒步骤合成各细胞的cDNA。使用SYBR Green染料检测各细胞中lncRNA BLACAT1的mRNA表达水平。引物设计BLACAT1：正向，5′-TGACGTCTTACTACACCCATCCT-3′和反向，5′-CTGCCACCTATAGGAAATGCG-3′；GAPDH：正向，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′和反向，5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′。

1.4 验证lncRNA BLACAT1对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

使用LipofectAMINE 2000转染si-BLACAT1于SW620细胞，同时设置si-NC组、blank control组。si-BLACAT1序列设计：5′-GAATTAGAAGCGAGGGGTT-3′。使用LipofectAMINE 2000在SW480SW620细胞中转染p-BLACAT1si-BLACAT1为si-BLACAT1组，并设置p-NCsi-NC组、空白对照组blank control组。细胞增殖利用CCK-8的方法，将转染24 h后的细胞以5×103/孔接种于96孔板，分别培养24 h、48 h、72 h后，根据试剂盒步骤检测细胞活力，酶标仪在450 nm处读取吸光光度值。细胞迁移通过Transwell检测，即转染24 h后的细胞5×104/孔于上室中，继续培养24 h，用4%多聚甲醛固定，通过DAPI染细胞核，荧光显微镜拍照记录，细胞迁移数目百分比计算细胞迁移率。侵袭实验利用Transwell上室接种转染24 h后细胞1×104/孔(含基质胶)，下室加入含10%的L-15培养基，继续培养24 h，4%多聚甲醛固定并使用DAPI染细胞核，荧光显微镜记录培养24 h后细胞侵袭能力。

设置blank control组、p-BLACAT1组、si-LEMD1组、p-BLACAT1+si-LEMD1组；blank control组、si-BLACAT1组、p-LEMD1组、si-BLACAT1 +p-LEMD1组，检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力，步骤同上。

1.5 lncRNA BLACAT1靶基因预测及qPCR筛选

starBase网站预测与lncRNA BLACAT1相互作用mRNA，选择四种靶基因LEMD1、CARS2、BAMBI、TCF12，qPCR检测SW620细胞和转染si-BLACAT1的SW620细胞中的几种可能靶基因的mRNA表达水平，Western blot验证靶基因的蛋白表达水平。引物设计LEMD1：正向，5′-CCATGTGAAGGGGATTCTACCAT-3′和反向，5′-GGGAGGTGAGACCAACAACT-3′；CARS2：正向，5′-ATGGCAGCCCTGAAGGTTCT-3′和反向，5′-CGGCTGGATACTTTAAGGCG-3′；BAMBI：正向，5′-CTAGAGAAGCAGGCGCTGAG-3′和反向，5′-ATCGCCACTCCAGCTACATC-3′；TCF12：正向，5′-TGTGCTTATCCTGTCCCTGG-3′和反向，5′-GAATTGTGGGTCCCATCTTGC-3′；GAPDH：正向，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′和反向，5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′。

通过starBase预测lncRNA BLACAT1与靶基因相互作用关系，双荧光素报告基因实验验证该基因为lncRNA BLACAT1的靶基因。

1.6 Western blot的检测方法

将细胞置于冰上裂解，离心提取细胞总蛋白，BCA方法检测蛋白浓度，向蛋白样本中加入上样缓冲液并加热变性，SDS-PAGE电泳并转膜，封闭抗体后孵一抗4℃过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)常温孵育，然后加入化学发光液与蛋白条带反应，凝胶成像仪检测LEMD1的蛋白表达量。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 lncRNA BLACAT1在结直肠癌组织中的表达

TCGA数据库(图1A)和10例结直肠癌患者(图1B)的癌组织样本中lncRNA BLACAT1的表达量均明显高于癌旁组织样本(P<0.001)，说明lncRNA BLACAT1在结直肠癌中可能发挥重要的生物学作用。

图1 lncRNA BLACAT1在结直肠癌组织中的表达差异Figure 1 The differential expression of lncRNA BLACAT1 in colorectal cancer and adjacent tissuesNote：A.The expression of lncRNA BLACAT1 in colorectal cancer tissues and adjacent tissues in the TCGA database；B.The differential expression of lncRNA BLACAT1 in colorectal cancer and adjacent tissues.*** P<0.001.

2.2 lncRNA BLACAT1在结直肠癌细胞系中的表达

lncRNA BLACAT1在结直肠癌细胞系SW620、SW480、HT-29、LoVo、HCT116中的表达显著高于正常结直肠细胞FHC(45.18±0.89，20.89±1.13，31.45±1.16，39.34±0.99，27.51±0.77vs. 1.00±0.05，P<0.001)，其中，SW620细胞中的BLACAT1表达量最高，SW480细胞中的表达量最低(图2)。

图2 正常结直肠上皮细胞与结直肠癌细胞中lncRNA BLACAT1的表达差异Figure 2 The expression of lncRNA BLACAT1 mRNA between normal colorectal epithelial cells and colorectal cancer cellsNote：*** P<0.001.

2.3 lncRNA BLACAT1对促进结直肠癌细胞的增殖迁移和侵袭的影响

三组SW620细胞各时间点细胞活力值存在统计学差异(F组别×时间=2674，P组别×时间<0.001)，48 h后，si-BLACAT组SW620细胞的细胞活力值显著低于blank control组和si-NC组(P<0.001)(图3A)。si-BLACAT组lncRNA BLACAT1的mRNA水平显著低于blank control和si-NC组(P<0.001)(图3B)。si-BLACAT组SW620细胞迁移和侵袭相对细胞数均显著低于blank control和si-NC组(P<0.001)(图4)。结果提示敲低lncRNA BLACAT1的SW620细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显降低。

2.4 预测lncRNA BLACAT1的靶基因为LEMD1

si-BLACAT组SW620细胞的LEMD1、CARS2、BAMBI和TCF12的mRNA水平均低于blank control和si-NC组(P<0.001)(图5A)，LEMD1 mRNA水平降低程度最高。Western blot实验结果显示，si-BLACAT组SW620细胞的LEMD1蛋白水平低于blank control和si-NC组(P<0.001)(图5B)。

图3 敲低lncRNA BLACAT1对SW620细胞活力及lncRNA BLACAT1 mRNA水平的影响Figure 3 The effects of knocking-down lncRNA BLACAT1 on cell viability and the level of lncRNA BLACAT1 mRNA in SW620 cellsNote：A.Knockdown of lncRNA BLACAT1 reduced viability of SW620 cells；B.Knockdown of lncRNA BLACAT1 reduced the level of lncRNA BLACAT1 mRNA in SW620 cells.***P<0.001，when compared with blank control and si-NC group.

图4 敲低lncRNA BLACAT1对SW620细胞迁移和侵袭的影响(DAPI染色×200)Figure 4 The effect of knocking-down lncRNA BLACAT1 on migration and invasion of SW620 cellsNote：A.The migration and invasion of SW620 cells were observed under a fluorescence microscope；B.The summary for percentage of migration and invasion in SW620 cells.when compared with blank control and si-NC group，*** P<0.001.

图5 lncRNA BLACAT1的靶基因预测Figure 5 Prediction the target gene of lncRNA BLACAT1Note：A.Knockdown of lncRNA BLACAT1 reduced the mRNA level of its predicted target gene LEMD1，when compared with blank control and si-NC group，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001；B.Knockdown of lncRNA BLACAT1 reduced the expression level of the target gene LEMD1；C.The correlation analysis of lncRNA BLACAT1 and LEMD1 by starBase；D.The double luciferase reporter gene assay was used to detect LEMD1 as the target gene of lncRNA BLACAT1.

图6 敲低LEMD1及过表达lncRNA BLACAT1对SW620细胞活力和转移的影响(DAPI染色×200)Figure 6 The effects of knocking-down LEMD1 and overexpressing lncRNA BLACAT1 on the viability and metastasis of SW620 cellsNote：A.The effects of knocking-down LEMD1 and overexpressing lncRNA BLACAT1 on the viability of SW620 cells；B.Fluorescence microscopy was used to observe the effects of knocking-down LEMD1 and overexpressing lncRNA BLACAT1 on the migration and invasion of SW620 cells；C.The percentage of migration invasion in SW620 cells；D.The effects of knocking-down LEMD1 and overexpressing lncRNA BLACAT1 on the expression of LE620 LEMD1 protein in SW620 cells.when compared with blank control，*** P<0.001.

starBase软件分析了471例结直肠癌患者组织中lncRNA BLACAT1与LEMD1mRNA水平的相关关系，结果表明lncRNA BLACAT1与LEMD1表达呈正相关关系(r=0.778，P<0.001)(图5C)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC组相比，LEMD1组的荧光活性明显增加，说明lncRNA BLACAT1能够参与LEMD1的表达活性调控，促进其核酸算转录和蛋白翻译，LEMD1是lncRNA BLACAT1的靶基因(图5D)。

2.5 lncRNA BLACAT1通过上调靶基因LEMD1表达对结直肠癌细胞的增殖迁移和侵袭的影响

48 h后，与blank control组相比，si-LEMD1组细胞存活率显著降低(P<0.001)，p-BLACAT1组细胞存活率显著增加(P<0.001)(图6A)。si-LEMD1组迁移和侵袭相对细胞数小于blank control组、p-BLACAT1组和p-BLACAT1+si-LEMD1组(P<0.001)，p-BLACAT1组迁移和侵袭相对细胞数大于blank control组、si-LEMD1组和p-BLACAT1+si-LEMD1组(P<0.001)(图6B-C)。Western blot实验结果证实，相比blank control组，si-LEMD1组LEMD1蛋白表达水平明显降低(P<0.001)，p-BLACAT1组LEMD1蛋白表达水平明显增加(P<0.001)(图6D)。结果说明lncRNA BLACAT1上调LEMD1蛋白表达促进SW620细胞增殖、迁移和侵袭。

3 讨论

结直肠癌作为患病率最高的癌症之一，死亡率较高，采用主要的治疗方案例如手术和化疗对晚期患者来说效果不佳，预后差。所以，寻找结直肠癌特征治疗靶点具有重要的意义。随着miRNA的发现，lncRNA也逐渐为人们熟知，现已发现其在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用[8]。研究肿瘤细胞中lncRNA的特征和功能，有利于我们从另一角度进一步了解癌症发生发展过程中的作用机制。

研究表明，存在多种lncRNA与结直肠癌的发展密切相关。H19是最早报道的长非编码RNA之一，它在不同癌症中的表达均上调，包括乳腺癌、肝胃肠道肿瘤、泌尿系肿瘤、呼吸系统肿瘤和脑肿瘤等[12]，H19与许多癌症的增殖、迁移、侵袭和转移有关，H19的过表达促进了结肠癌细胞的上皮间质转化和肿瘤增殖[12-14]。HOTAIR的异常表达与乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关，并影响患者的生存和预后[15]。MALAT1最初被认为是mRNA前剪接调节因子，它通过结合组蛋白修饰酶和转录因子来调节基因转录，并通过结合miRNAs的海绵作用转录后调节mRNA和蛋白质的表达，在人类不同器官来源的癌症组织，特别是转移癌组织中表达上调[16]。本研究根据前人文献中报道的结果，选择了一种在结直肠癌患者中高表达的lncRNA BLACAT1[17]。lncRNA BLACAT1在骨肉瘤中表达上调，并可以与STAT3相互作用，调节STAT3的磷酸化，促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[18]。作为一种结直肠癌患者的特征标志物，lncRNA BLACAT1在G1/G0期阻滞中起关键作用，并且lncRNA BLACAT1可通过与EZH2结合抑制p15的表达，从而调节结直肠癌细胞的周期和增殖[17]。目前该基因在结直肠癌中的增殖和转移的作用机制还未知。所以我们首先检测了肿瘤组织与癌旁组织中lncRNA BLACAT1的转录水平，并检测了不同结直肠癌细胞系中lncRNA BLACAT1的转录水平。结果表明肿瘤组织中lncRNA BLACAT1的转录水平上调，在SW620细胞中lncRNA BLACAT1的转录水平明显上调。其次，我们研究了lncRNA BLACAT1转录水平的变化对SW620细胞增殖、迁移和侵袭的影响。在SW620细胞中敲低lncRNA BLACAT1抑制了其增殖、迁移和侵袭能力。随后，我们探讨了lncRNA BLACAT1促进结直肠癌细胞增殖和转移的作用机制。通过starBase数据库检索的结果，选择了几种与lncRNA BLACAT1可能存在相互作用的基因，为了验证这一结果，采用荧光定量PCR技术检测敲低lncRNA BLACAT1对几种基因转录水平的作用效果。结果显示，LEMD1的转录水平降低最明显，并且Western blot验证了该结果，初步表明lncRNA BLACAT1与LEMD1存在正向调控的关系。后续通过starBase数据库检索，同样表明lncRNA BLACAT1与LEMD1呈正相关，并通过双荧光素酶报告基因实验验证了LEMD1为lncRNA BLACAT1的靶基因。LEMD1是癌-睾丸抗原(CTA)编码蛋白，早期在前列腺癌和间变性大细胞淋巴瘤中发现其存在过表达[19]。基因表达谱检测发现，LEMD1在结直肠癌中的表达水平高于其相应的非癌粘膜中的表达水平[20]。研究表明，在口腔鳞状细胞瘤细胞中敲低LEMD1抑制了癌细胞的侵袭[19]，表明该基因与癌细胞的增殖和转移相关[21]。最后，为了证明是否是因为lncRNA BLACAT1增加LEMD1的表达进而促进结直肠癌细胞增殖和转移，我们采用回复实验证实了过表达lncRNA BLACAT1将增加LEMD1的表达及SW620细胞的增殖和转移，敲低LEMD1将逆转这一结果。

综上所述，结直肠癌细胞SW620中lncRNA BLACAT1表达量增加，并上调LEMD1的表达，进而促进细胞增殖、迁移和侵袭。但是，其过程涉及的具体机制还需要深入研究。此研究为充分理解lncRNA BLACAT1在结直肠癌中的作用机制提供基础。