肉桂醛对口腔鳞状细胞癌细胞CAL27增殖和迁移的影响

许嘉琪，单秋生，王晓峰

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)(简称鳞癌)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤[1]，其复发和转移对患者构成很大的威胁。OSCC尽管在系统化和个性化的治疗方面已经取得非常大的进展，但肿瘤细胞的转移及放化疗的痛苦仍然给其治疗带来很大挑战[2]。因此，寻找高效低毒副作用的药物来提高OSCC患者的生存质量，研究OSCC的增殖、迁移和上皮间充质转化，成为目前临床基础研究的重要课题。

肉桂醛(cinnamaldehyde, CA)是一种醛类有机化合物，淡黄色液体，可从桂皮油中分离而得。研究发现，肉桂醛具有防腐保鲜、抗溃疡、加强胃肠道运动、抗病毒、扩张血管及降压、分解脂肪等多种作用[3-5]。国内外大量研究现状表明，肉桂醛可通过不同途径对黑素瘤、肺癌、宫颈癌等产生抑制作用[6-8]。肉桂醛在临床抗肿瘤方面具有较大研究潜力[9]，而肉桂醛对口腔癌的抑制作用鲜有报道。本文旨在探讨不同浓度肉桂醛在体外二维条件下对口腔鳞癌细胞CAL27的增殖、迁移、侵袭、凋亡和上皮间充质转化的影响，为肉桂醛在抗口腔鳞状细胞癌方面提供相关的研究和进展。

1 材料与方法

1.1 材料

人舌鳞癌细胞CAL27细胞系(BNCC细胞菌种库)；肉桂醛(生工生物工程上海股份有限公司，纯度为1.05 g/mL)；CCK8试剂盒(Cell Counting Kit-8，BBI Life Sciences 公司)；兔抗人Vimentin单克隆抗体(abcam 公司)；兔抗人E-cadherin单克隆抗体(Proteintech 公司)；兔抗人β-actin单克隆抗体、兔抗人Snail单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记抗兔IgG(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 肉桂醛溶液的配置

取500 μL肉桂醛原液，溶于9.5 mL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中，配置成0.05 g/mL的母液，-20 ℃避光保存，现用现配。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人舌鳞癌细胞CAL27细胞系购自BNCC细胞菌种库。用含10%灭活胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素(100 U/mL)和1%链霉素(100 μg/mL)的DMEM培养基进行细胞培养，放入37 ℃、5%CO2的细胞恒温培养箱中进行孵育。

1.3.2 CCK8法检测肉桂醛对CAL27细胞增殖的毒性作用 将处于对数生长期的CAL27细胞接种于96孔板内，2×104个细胞/孔，100 μL培养基/孔。放入37 ℃、5% CO2的细胞恒温培养箱中孵育24 h。将其分为实验组和对照组，分别用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的培养基处理实验组细胞，用含0.08%DMSO的培养基处理对照组细胞，每组浓度设置5个复孔。放入37 ℃、5% CO2的细胞恒温培养箱中分别孵育0、24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8 solution，孵箱内避光孵育40 min，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。实验重复3遍。

1.3.3 细胞划痕实验 将处于对数生长期的CAL27细胞接种于6孔板内，5×105个细胞/孔，2 mL培养基/孔。放入37 ℃、5% CO2的细胞恒温培养箱中孵育24 h。细胞铺满底壁，用20 μL移液枪的枪头在培养皿底部均匀划线，PBS洗细胞3遍，分别用含4、12、20、28 mg/L肉桂醛的无血清培养基处理实验组细胞，用含0.08%DMSO的无血清培养基处理对照组细胞。用倒置显微镜，按0、6、12、24 h时间点取样，在放大100倍下进行拍照，划痕位置居中且垂直。实验重复3遍。

1.3.4 Transwell小室侵袭实验 用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的无血清培养液重悬实验组CAL27细胞，用含0.08%DMSO的无血清培养液重悬对照组CAL27细胞，进行细胞计数。每个transwell上室(8.0 μm孔径)内接种200 μL含5×104个细胞的培养液，每个24孔板下室加入500 μL含10%FBS的培养基。加药处理24 h后，用无菌小棉签轻柔擦掉上室内未穿膜的细胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min。用倒置显微镜，随机选取5个视野，观察细胞并计数。实验重复3遍。

1.3.5 流式细胞术 CAL27细胞系经细胞培养、传代后，将其分为实验组和对照组，分别用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的培养基处理实验组细胞，用含0.08% DMSO的培养基处理对照组细胞。加药处理48 h后，用不含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)的胰酶进行消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞，用PBS重悬细胞并进行细胞计数，每个流式管取5×105个重悬的细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，每管加入100 μL Binding Buffer、10 μL PI、5 μL Annexin Ⅴ-FITC室温下避光孵育15 mim，每个流式管内加入400 μL Binding Buffer，混匀后上机检测。实验重复3遍。

1.3.6 Western blot CAL27细胞系经细胞培养、传代后，将其分为实验组和对照组，分别用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的培养基处理实验组细胞，用含0.08% DMSO的培养基处理对照组细胞。加药处理48 h后，进行蛋白提取与蛋白浓度测定，样本蛋白裂解液与5×蛋白上样缓冲液混匀，100 ℃沸水浴10 min。制备SDS-PAGE凝胶，点样后进行电泳分离并电转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含5%脱脂奶粉的Tris-HCL缓冲液(Tris buffered saline Tween, TBST)室温下摇床封闭1 h，TBST漂洗3次，5min/次。用一抗稀释液稀释相应的一抗(1∶1 000)，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃摇床过夜。室温下摇床TBST洗膜6次，5 min/次。用TBST稀释经过HRP标记的二抗(1∶5 000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温下摇床孵育2 h。室温下摇床TBST洗膜6次，5 min/次。通过扫膜仪进行显色曝光。实验重复3遍。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 肉桂醛在体外条件下对CAL27细胞增殖的抑制作用

通过CCK8实验检测肉桂醛对口腔鳞癌细胞CAL27增殖性的抑制作用。实验组药物浓度梯度采用4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L，实验结果如图1，结果显示，与对照组相比，肉桂素处理组在0、24、48、72 h都能够呈剂量依赖性抑制细胞活性。经肉桂醛处理的实验组呈作用时间和药物浓度依赖性抑制CAL27细胞的增殖。

图1 CCK8检测口腔鳞癌细胞CAL27增殖

2.2 肉桂醛在体外条件下对CAL27细胞迁移能力的抑制作用

通过划痕实验检测肉桂醛对CAL27细胞的迁移能力是否具有抑制作用。结果显示，在划痕6 h的CAL27细胞中，各组间迁移距离无明显差异。在划痕12 h的CAL27细胞中，与对照组相比，肉桂醛处理组随药物浓度升高抑制细胞迁移距离。在划痕24 h的CAL27细胞中，与对照组相比，肉桂醛处理组呈剂量依赖性抑制细胞迁移能力，其差异具有统计学意义(P<0.05)。结果如图2。

图2 划痕实验检测CAL27迁移( ×100)

2.3 肉桂醛在体外条件下对CAL27细胞侵袭能力的抑制作用

根据CCK8实验结果，transwell小室侵袭实验实验组药物浓度梯度采用4、12、20、28 mg/L，实验结果如图3，在CAL27细胞中，药物作用24 h后，单个视野中，对照组细胞穿膜数目为(137.0±1.7)个，实验组细胞穿膜数目依次为(90.0±2.6)、(75.0±3.1)、(35.0±2.3)、(7.0±1.1)个。与对照组相比，肉桂醛处理能够呈剂量依赖性抑制细胞侵袭能力，其差异具有统计学意义(P<0.05)。

A～E:药物浓度梯度0、4、12、20、28 mg/L

2.4 肉桂醛在体外条件下对CAL27细胞凋亡的促进作用

为探讨肉桂醛对口腔鳞癌细胞CAL27的凋亡是否具有促进作用，测定CAL27细胞凋亡率。流式细胞术实验组药物浓度梯度采用4、12、20、28 mg/L，实验结果如图4，药物作用48 h后，对照组细胞凋亡率为(14.59±0.79)%，实验组细胞凋亡率依次为(20.69±1.12)%、(26.38±0.83)%、(35.53±1.21)%、(66.48±0.83)%。与对照组相比，肉桂醛处理能够呈剂量依赖性促进细胞凋亡，其差异具有统计学意义(P<0.05)。

图4 流式细胞术检测CAL27细胞凋亡

2.5 肉桂醛在体外条件下对CAL27细胞上皮间充质转化的影响

通过Western blot实验检测肉桂醛对CAL27的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是否产生影响。实验结果如图5，药物作用48 h后，与对照组相比，肉桂醛处理能够呈剂量依赖性抑制蛋白Vimentin，Snail表达，其差异具有统计学意义(*：P<0.05;***：P<0.001)；肉桂醛处理能够呈剂量依赖性促进蛋白E-cadherin表达，其差异具有统计学意义(***：P<0.001)。

图5 Western blot 检测CAL27上皮间充质转化的影响

3 讨 论

OSCC作为最常见的口腔颌面部恶性肿瘤，根据组织来源好发于舌部，舌体组织具有灵敏的活动度，血液循环丰富，淋巴结转移率也比较高[10-11]。故本实验选取人舌鳞癌细胞CAL27细胞系(该细胞系源自一位男性，56岁，白种人，舌中部病变部位，角蛋白呈强阳性)。化疗作为晚期舌部鳞状细胞癌患者综合序列治疗的重要辅助手段，存在难以避免的不良反应及并发症，这将严重影响到患者的生存质量[12-13]。因此，寻求不良反应小、低毒副作用、并发症少的治疗药物，成为目前临床基础研究的重要课题之一。

中西医结合作为目前综合治疗肿瘤的手段之一，可以在一定程度上减轻手术结合放化疗带来的不良反应。越来越多的中草药已经用于增强化疗药物的抗肿瘤效果并降低其毒副作用[14-15]。肉桂醛及其衍生物是研发口腔鳞状细胞癌新型抗肿瘤药物的候选药物[16]。目前国内外研究表明，肉桂醛能够在体外抑制黑素瘤A375细胞的侵袭能力及NF-kB的活化[17]；肉桂醛通过上调蛋白P21表达和下调CDK4表达，促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡[18]；人肝癌细胞HepG2的研究表明肉桂醛通过增加蛋白P21表达和降低CDK4表达，抑制HepG2细胞增殖[19]；肉桂醛通过下调 Bcl 2和 Mcl 1抗凋亡蛋白表达、上调促凋亡蛋白Bax,引起下游凋亡蛋白酶Caspase3和Caspase9活化，干扰细胞周期进程，诱导食管癌Eca109细胞凋亡[20]。本实验Western blot研究发现，经不同浓度肉桂醛(4、12、20、28 mg/L)处理48 h后的CAL27细胞，呈剂量依赖性抑制蛋白Vimentin、Snail表达，促进蛋白E-cadherin表达。EMT在肿瘤细胞的迁移中发挥了重要作用[21-23]。Vimentin作为中间丝中的一种蛋白质，用于维持细胞骨架的完整性。钙黏着蛋白E-cadherin介导钙依赖性细胞的胞间粘附，并在正常组织发育中发挥重要作用，是上皮癌浸润生长的活性抑制蛋白[24]。在上皮肿瘤细胞系中，Snail和E-cadherin的mRNA水平呈负相关，Snail可抑制E-cadherin的转录[25-26]。然而肉桂醛通过影响EMT从而对细胞CAL27迁移产生抑制作用的相关机制还需进一步研究和探讨。

本实验旨在研究不同浓度肉桂醛在体外二维条件下对口腔鳞癌细胞CAL27的增殖、迁移、侵袭、凋亡和上皮间充质转化的影响。CCK8显示，肉桂醛呈作用时间和药物浓度依赖性抑制CAL27细胞的增殖。划痕实验和transwell小室侵袭实验结果表明，肉桂醛呈剂量依赖性抑制CAL27细胞的迁移和侵袭能力。流式细胞术显示，肉桂醛呈剂量依赖性促进CAL27细胞凋亡。Western blot表明，肉桂醛通过EMT过程对CAL27的迁移产生抑制作用。肿瘤细胞增殖和迁移的过程十分复杂，肉桂醛对口腔鳞癌细胞CAL27抑制作用的相关调控机制尚不清楚，以上结论还需其它实验进一步验证。