基于宏基因组技术分析传统酸笋中微生物多样性

陈晓东 ， 朱志勇 ， 张 韫 ， 吴昌明 ， 郭起荣 *2，

（1. 国际竹藤中心 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室，北京100102；2. 南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京210037）

酸笋是以鲜笋为原料，经过天然混合菌群发酵而成的一种传统食材，因为其良好贮藏特性和独特的风味，受到广大消费者的喜爱。 早在《诗经》中就有“加豆之实，笋菹鱼醢”的记载。 笋菹即酸笋。 现今，如我国西南地区的螺蛳粉、多民族酸食，酸笋皆为其常见配料。 闽、赣、黔、湘、鄂、川、渝等地的侗、苗、瑶和汉族人，四季皆喜食酸笋。 酸笋中的乳酸菌不仅具有益生功能[1-2]，而且还能产生丰富的挥发性风味物质、有机酸、细菌素等，食用品质大为提高[3-4]。随着人们生活水平的提高，诸如高血压、高血脂、糖尿病、 心脑血管疾病等常见疾病愈发引起社会关注。 竹笋作为森林蔬菜之一，其肉质鲜嫩，营养丰富，富含膳食纤维、多种氨基酸和维生素，同时含有铁、磷、镁、钙等矿质元素[5]，已然成为人们重要的副食品之一。 研究表明，竹笋采后易木质化，食性锐减。 有些种类常温下贮藏2~3 d 后便失去鲜嫩口感[6]，竹笋保鲜贮藏加工成为其大规模生产和流通的关键瓶颈。 而酸笋容易保存，且风味更佳。 Bekele A Z等研究发现，酸笋的膳食纤维具有改善并调节小鼠胃肠道菌群、润肠通便的保健功能[7]。 Singh 等研究发现，酸笋还具有抗氧化的功能[8]。 此外，微生物在酸笋发酵过程中发生一系列变化，因此分析微生物对酸笋质量及风味的形成有重要意义。 目前，W Romi 等利用16S rRNA 对印度传统酸笋菌微生物动态进行了检测[9]，Buddhiman T 等发现 L. brevis、L. plantarum、L. fallax 是酸笋美食 Soibum 的主要微生物[10]。 我国酸笋多集中于营养成分、口感、风味等研究[11]，传统培养法和16S rRNA 基因分析仅提供了关于微生物组成的有限信息[12]，大量的微生物种类、功能不明确，缺乏对酸笋微生物宏基因组系统深入的解析。 近年来，宏基因组测序技术的不断进步，为解析环境中复杂的微生物体系提供了一种便捷、有效的方法，在发酵食品如泡菜、黄酒、红茶、酸粥等领域得以应用[13-16]。 作者采集广西6 个传统产地的酸笋， 对其微生物进行Illumina Hiseq 宏基因组测序和分析， 为更全面掌握酸笋微生物种类、特征及酸笋品质创新、加工业发展提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品以及来源

2017 年8 月，取样于广西的桂林、柳州、来宾、百色、南宁、贵港6 个地区，见图1。选择当地酸笋做得道地的农户， 泡制酸笋的材料为麻竹笋（Dendrocalamuslatiflorus Munro）。 在酸笋坛中用 5 mL 无菌移液器从笋坛的上、中、下部位各取10 mL发酵液， 总量30 mL 置于50 mL 无菌离心管中混合，重复3 次，样品置于液氮条件下保存，运回实验室待测，采集地情况见表1。

天根植物基因组提取试剂盒、缓冲液GA：购自天根生化科技（北京）有限公司；PBS 缓冲液：购自江苏绿叶生物科技有限公司。

高速低温离心机ALLSHENG ICEN 24：购自杭州奥盛公司；Qubit 2.0 DNA 检测试剂盒： 购自Life公司；DYY-11 电泳仪： 购自北京市六一仪器厂；Illumina Hiseq 测序仪：购自美国Illumina Hiseq 公司。

1.2 宏基因组DNA 提取

图1 酸笋样品采集地点Fig. 1 Collection sites of fermented bamboo shoots

表1 酸笋样品采集信息Table 1 Information of fermented bamboo shoots samples

将30 mL 酸笋发酵液样品从液氮中取出，融化后置于50 mL 大离心管中， 于4 ℃高速离心机12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，再用 PBS 洗涤大离心管中沉淀物，将菌体收集在1.5 mL 的EP 管中，用于总DNA 提取。 采用天根植物基因组提取试剂盒[17]提取样品中所有微生物的总 DNA。 经0.8 g/dL 琼脂糖凝胶电泳（电压100 V，时间40 min）检测无明显降解、 无杂质， 质量合格样品， 利用Qubit 对总DNA 质量浓度进行精确定量（DNA 质量浓度≥30 ng/μL，DNA 质量≥3 μg），保证达到二代测序文库构建要求。

1.3 文库构建及Illumina HiSeq 高通量测序

检测合格的DNA 样品用超声波破碎仪随机打断成300 bp 的片段，经末端修复、加A 尾、加测序接头、凝胶法纯化、PCR 扩增等过程完成文库构建，同时使用Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至2 ng/μL，采用实时荧光核酸扩增检测系统（Q-PCR）方法对文库的有效浓度进行精确定量（文库有效浓度＞3 nmol/L），以保证文库质量。 宏基因测序在北京源宜基因科技股份有限公司进行。

1.4 数据分析

先将HiSeq 原始测序数据进行质控，得到高质量的有效读长（reads）。 使用 MetaPhlAn2[18]软件进行微生物种类注释，高通量解析酸笋微生物组成与数量。 其中，α 多样性是指生境内物种多样性程度、丰富度（包含物种的多寡）和均匀度（样品中各个种类的相对密度）两个指标，使用mothur 软件[19]进行分析。β 多样性能反映时空尺度上物种的组成变化，分析不同地区样品间（组间）的微生物组成差异，使用Jaccard 软件[20]进行分析。不同组分共有种越少，则β多样性越大。 将Unigene 与KEGG 数据库进行比对统计（http：www.genome.jp/kegg）。

2 结果与分析

2.1 HiSeq 测序结果统计分析

桂林、柳州、来宾、百色、南宁、贵港等6 地麻竹酸笋发酵液宏基因组测序获得的宏基因组数据见表2。其中平均读长141.2 bp，有效读长68.75 M，占原始read 的91.5%；有效碱基数9.697 G，占原始碱基数的85.9%。 相较于 16S 测序的序列读长约200 bp，有效数据量在10~70 M 之间[21]，本次宏基因组测序共产生有效数据58.18 G （每个样本平均为9.69 G），有较高的文库覆盖度，捕获了样品中更多微生物。

将有效读长通过SOAPdenovo2[22]进行迭代拼接（overlap），得到 66 157 个更长的片段（scaffold），将获得的scaffold 使用MetaGeneMark[23]进行基因预测，共测得75 681 个基因。将预测出来的基因序列使用CD-HIT[24]软件进行聚类 （参数为：95%相似度、90%覆盖度）， 得到 54 416 个非冗余基因集（unigene），用于生物信息学分析。

表2 不同地区酸笋微生物宏基因组测序结果Table 2 Microbialmetagenomic sequencing results of different regions fermentedbamboo shoots

2.2 酸笋微生物群落结构分析

通过MetaPhlAn 2 软件对有效读长进行物种分类，MetaPhlAn 2 基于 17 000 个已有的基因组（13 500 原核生物，3 500 病毒，110 真核生物） 得到约一百万个特异性的标记， 分类水平达到种水平。从所采集的6 个地区18 个酸笋样品中， 鉴定出156 种微生物，隶属于 9 门 16 纲 30 目 63 科 92 属。酸笋基因集中有71.9%可以在总界水平上进行分类，其中细菌（Bacteria）占已分类基因的98.89%，其余1%来自真菌（Eukaryota）、古菌（Archaea）和病毒（Viruses）。

在门水平上，18 个样品中共检测到8 个门，见表3。 超过98.86%的细菌基因来自4 个主要的门类，分别为厚壁菌门（Firmicute）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria），其中硬壁菌门的比例高达86.10%；真菌基因主要为子囊菌门 （Ascomycota）， 比例仅为0.001%。 与 Romi.W 等[9]以 PCR-DGGE 结合 16S 测序为手段分析印度酸笋菌群结构仅发现硬壁菌门和子囊菌门两个门的微生物相比， 本研究结果显示，微生物宏基因组的技术先进性。

18 个样品中共检测出92 个属，见图2。 桂林、柳州、来宾、百色、贵港5 个产地的主要菌属为乳杆菌属（Lactobacillus），丰度为 81.06%～99.17%；南宁产地的酸笋主要菌属还包含假单胞菌属（Pseudomonas），丰度为32.24%；此外还包括片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳球菌属（Lactococcus）等具有益生功能的微生物，与泡菜[25]、酸菜[21]、酸粥[16]等传统发酵食品的主要微生物大体相同，见表4。乳球菌属对发酵乳的酸化和风味的形成贡献较大[26]，其对酸笋风味的形成亦有重要的作用。 从属的分类级别来看，本次宏基因组测序与16S 测序的鉴定结果水平相当[26]，但在种水平上，宏基因组测序检测出的微生物种类则更丰富。 本研究中18 个样品中鉴定到植物乳杆菌（L. plantarum）等 12 种乳杆菌，见表 5。 而Romi.W[9]等在印度酸笋中仅发现 L. brevis、L. plantarum 和L. lactis 3 种乳杆菌，远远低于本研究结果。 可能的原因是16S 测序大多数只能注释到属水平， 而宏基因组测序可直接注释到种水平，还可以从基因和功能层次进行更深入分析。 同时，6个产地酸笋微生物的种类和数量也存在着一定的差异，可能由于采样地区的地理位置、气候、农户制作酸笋工艺（发酵时长、发酵温度、容器）等客观因素引起。

表3 门水平上样品中微生物的相对丰度Table 3 Relative abundance of microbial at phylum levels in each sample

图2 属水平上酸笋微生物菌群相对丰度Fig. 2 Microbial relative abundance on the genus level in thefermented bamboo shoot

表4 4 种传统发酵食品的主要微生物Table 4 The main microbials of 4 traditional fermented foods

表5 不同地区酸笋乳酸杆菌的相对丰度Table 5 Relative abundance of Lactobacillus in different areas

2.3 酸笋微生物α 多样性分析

α 多样性是生境中微生物丰富度和均匀度的综合指标[27]，本研究所得到微生物物种数、均匀度指数、shannon 指数等信息参见表 6。 Shannon 指数反映样品微生物的丰富程度[28]。结果表明，贵港样品中观察到的微生物物种数多达77 种， 与其他地区具有显著差异。 南宁地区样品均匀度指数最高为0.69，表明该地区物种分布更均匀。

表6 不同样品细菌的多样性指数、均匀度指数及丰度Table 6 Bacterial diversity index，evenness index and abundance of different samples

2.4 酸笋微生物β 多样性分析

2.4.1 群落距离分析 以检测到微生物属水平数量为指标，采用Jaccard 方法，考虑物种组成、不考虑其丰度，计算样品间的群落距离、生成距离矩阵，进行距离热图分析，结果见图3。 可以聚为3 类：桂林、 柳州、 来宾3 个产地酸笋微生物群落距离在0.44～0.57 之间，根据微生物相对丰度的分布的分析发现，发酵乳杆菌含量均最多，说明这3 个产地细菌群落结构更相似；百色、南宁2 个产地酸笋微生物群落距离为0.7，植物乳杆菌为丰度最高；而贵港产地酸笋与其他5 个产地群落距离大，布氏乳杆菌为主要菌种，说明贵港与其他5 个产地酸笋的细菌群落结构差异更大。

2.4.2 酸笋微生物主成分分析 PCA 是一种非限制性排序的组间差异分析方法 （即只考虑物种组成）， 基于Jaccard 算法计算样本中的物种距离，将原始复杂信息进行降维排序，找出数据中最主要的元素或结构，样品组成越相近，反映在PCA 图中的距离越近。结果见图4。前三个主成分贡献率分别是38.2%、29.3%、18.9%，累计贡献率达86.4%，符合主成分分析要求。

图3 不同产地酸笋微生物群落的距离热图Fig. 3 Heatmap of microbialcommunities distance of fermented bamboo shoot from different regions

PCA 结果表明，桂林、柳州、来宾3 个产地酸笋微生物群落结构相似，可以聚为一类；百色、南宁2个产地酸笋微生物群落结构相似，聚为一类；贵港与其他5 个产地酸笋的微生物群落结构差异较大，单独聚为一类。 主成分分析结果与群落距离热图分析结果相一致，地理距离的差异可能是造成酸笋微生物群落结构不同的主要因素，产地越近，群落结构越相似。

2.5 功能基因KEGG 统计

将非冗余基因集与KEGG 数据库进行对比，共有 19 743 个 unigene 得到注释。 其中 12 751 个unigene 参与微生物新陈代谢， 分属385 类代谢通路。 其中发现了49 条碳水化合物代谢通路，主要包括糖酵解、磷酸戊糖代谢、三羧酸循环等代谢途径，这些代谢途径产生了大量的乙酸、苹果酸、丁酸等有机酸丰富了酸笋的风味；30 条代谢氨基酸代谢通路，其中包括苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸3 种必需氨基酸的代谢途径， 同时部分unigene 参与基因维生素及其他辅助因子的代谢，结果见图5。有关生物系统，人类疾病，细胞移动，细胞对环境信息处理，遗传信息的传递注释基因数量相对较少。

图4 酸笋微生物在属水平的PCA 分析Fig. 4 PCA analysis of the bacteria of fermented bamboo shoot

3 讨 论

酸笋与云南豆豉、四川泡菜、东北酸菜等传统发酵食品相比，以其独特的风味、丰富的营养及益生功能受到人们的欢迎[29-30]。 目前，国内外学者利用传统培养法和16S 测序对中国台湾、泰国、印度、印度尼西亚等地酸笋[31-34]研究表明，L.plantarum、L.buchneri、 L.brevis、 L.fermentum、 Enterococcus faecium 是这些酸笋中的主要微生物，这与本实验结果具有共同性的同时也存在一定的差异。 除上述菌种以外，我国酸笋中还发现了L.rossiae、 L.pentosu、L. amylolyticus 等乳酸杆菌， 菌群种类更加丰富，是宏基因组技术发现更多还是其特有，还有待进一步研究。 同时6 个产地酸笋微生物的种类和数量也存在一些差异， 可能是由于采样地区的地理位置、环境气候、制作方法等因素造成的。

图5 功能基因KEGG 统计Fig. 5 KEGG analysis of functional genes

本研究结果表明， 酸笋中存在多种有益微生物， 如 L. plantarum 具有高产叶酸的功能[35]，Pediococcus pentosaceus 等具有提高免疫功能、Leuconos toccitreum 产生具有广谱抑菌作用的细菌素[36]，Alistipes putredinis 可调节人体肠道菌群[37]、Prevotella 可降解淀粉、蛋白质[38]。 同时，酸笋富含的膳食纤维是肠道菌群最好的养料，细菌消化纤维生成的短链脂肪酸能滋养肠屏障， 提高免疫机能，帮助预防炎症，抵抗肿瘤发病风险[7]。 酸笋的益生性表现在其中的乳酸杆菌代谢产生的诸如有机酸、过氧化氢、细菌素等物质，具有促进营养吸收、较强的抗氧化、抑制病菌等能力。

酸笋中少量的真菌、古菌、噬菌体病毒均为发酵食品中常见的微生物。 德巴利酵母科（Debaryomycetaceae）在冰葡萄酒酿造过程中，提高冰葡萄酒风味和口感[39]；Halococcus 可产生多种胞内、胞外多糖酶，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶[40]，这些酶在高盐度的环境中显示良好的活性；Siphoviridae、Myoviridae 噬菌体病毒与Lu Z[41]等在泡菜中分离出26 种不同的噬菌体研究结果一致。虽然这些微生物在提高风味等方面具有一定的作用，但是在食用酸笋之前提倡加热烹饪，利用高温杀死酸笋中一些有害的细菌及病毒，保证食用安全。 发现酸笋发酵液中微生物存在多样性，各菌群的功能尚有待进一步深入研究。

4 结 语

广西传统麻竹酸笋样本中含有8 门16 纲30目63 科92 属156 种的微生物，不同地区微生物群落组成略有不同，同时均伴生有其他种类的细菌或真菌，在属水平上，乳杆菌属丰度高达81%，片球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、乳球菌属丰度均不足1%，这些都是发酵体系中广泛存在的乳酸菌。 植物乳杆菌等12 种乳酸杆菌是我国广西产地酸笋微生物的主要菌种。 产地间微生物有地区差异，产地越近，微生物的群落结构越相似。