1，25(OH)2D3/VDR 对湿疹患儿 miRNA155/SOCS1通路的调节作用

江永青，汪红，胡颖，胡志坚，詹忠明，何媛

（九江学院附属医院检验科， 江西 九江 332000）

湿疹，通常被称为“特应性皮炎”，是一种表皮及真皮浅层的慢性炎症，其在儿童中发病率远高于成人，发病高峰期发病率可达到28.7%[1]。湿疹临床可表现为慢性反复发作的皮肤瘙痒、干燥和疼痛，生活质量下降，甚至导致抑郁症状、社会隔离以及自我认同感下降等精神心理疾患，同时也为社会造成巨大的经济负担。 其发病机制尚不明确，目前认为与自身免疫功能和皮肤屏障功能有关。 近期研究显示维生素D 经代谢形成的活性产物--维生素D3(，1，25-dihydroxyvitamin D3， 1，25(OH)2D3）与多种免疫相关性疾病有关，如哮喘、荨麻疹、食物过敏等[2，3]。 而只有表达维生素 D 受体(vitamin D receptor，VDR）的组织器官才能有效发挥活性维生素D的作用。 此外， 1，25 (OH)2D3/VDR 是否通过 miRNA155/SOCS1 通路参与湿疹的发生， 尚不清楚。为此本实验检测湿疹患者 1，25 (OH)2D3、VDR、 miRNA155 及 SOCS1 表达量的变化，探讨 1，25(OH)2D3/VDR 对湿疹患儿miRNA155/SOCS1 通路的调节作用，为湿疹的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 选取 2016 年 1 月-2018 年 7 月在九江学院附属医院就医的湿疹患儿108 例，男性57 例，女性 51 例， 平均年龄 5.4±3.5 岁。 正常对照组 77例，均来自外科手术患儿，皮肤组织无病变，其中男 42 例，女 35 例，平均年龄 6.2±4.1 岁，其性别、年龄与患者相匹配。 湿疹患者的诊断及分期均符合赵辨主编的《中国临床皮肤病学》第四版[4]。 入选实验对象标准：⑴临床医生确诊为湿疹的患者；⑵排除严重心肺功能不全和肝肾功能不全者； ⑶2周内未局部外用皮质类固醇激素、维生素D3 衍生物、钙调磷酸酶抑制剂及免疫抑制剂;⑷近1 个月未系统应用糖皮质激素、补骨脂素、阿维A 等系统治疗及日光浴、紫外线治疗；⑸未合并皮肤真菌、病毒等感染类疾病或其他相关皮肤病患者;⑹无药物过敏史；⑺符合伦理道德，遵循知情同意原则。

1.2 方法

取患者与健康对照组静脉血5ml (促凝管)，采用罗氏Cobas 6000 自动生化免疫分析仪， 用电化学发光法检测患者血清1，25(OH)2D3含量。 试剂盒由罗氏诊断公司提供。

取患者与健康对照组外周静脉血50μl (EDTA抗凝)，采用流式细胞术检测患者T 细胞百分比。 6 C-TBNK(美国 BD 公司， 批号:90646)避光孵育 20 min， 用含 0.5%BSA 的 PBS 洗 2 遍， 流式细 胞 仪(美国， BD FACSCanto TMII) 检测。

取患者皮损处组织与对照组皮肤组织， 采用Trizol 法提取总 RNA，反转录合成 cDNA。 以 cDNA 为模板、 以 β-actin 为内参基因进行 RT-PCR反应。 采用实时荧光 PCR 仪(美国，A&B 7500 Real Time PCR System)检测 VDR、miRNA155、SOCS1 及β-actin 表达。 引物均通过 GenBank 检索得到：VDR F-5' ATGCCATCTGCATCGTCTC 3'，R-5'GCACCGCACAGGCTGTCCTA 3'；miRNA155 F-5'TAATGCTAATCGTGATAGGG3'，R -5'TTTGGCACTAGCACATT3'；SOCS1 F-5′ CTTCTGTAGGATGGTAGCACAC -3'，R -5′ AGGAAGAGGAGGAAGGTTCT-3'；β-actin F-5’ TGGCACCCAGCACAATGAA 3’，R-5’ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 3’。

1.3 统计学处理 实验数据采用SPSS12.0 统计软件包进行统计学处理， 运用均数±标准差±s 表示，进行方差分析， 计量资料比较方法采用SN—K 法两两比较。 RT-PCR 数据采用 2-△△ct法处理，将各基因的Ct 值减去β -actin 的平均Ct 值作为△Ct 值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 湿疹患者与健康对照组血清1，25(OH)2D3浓度的变化 湿疹患者血清 1，25 (OH)2D3含量 29.25±11.03 nmol/L， 健康对照组为 55.49±21.66 nmol/L，湿疹患儿明显低于健康儿童（P＜0.05）。

2.2 湿疹患儿淋巴细胞亚群的分析 结果显示，湿疹患儿 T 细胞亚群（CD3+，%）及 CD4+的 T 淋巴细胞亚群（CD3+CD4+，%）明显高于对照组，CD8+的 T淋巴细胞亚群（CD3+CD8+，%）明显低于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 各组T 淋巴细胞亚群的比较（±s）

表1 各组T 淋巴细胞亚群的比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

CD3+(%)对照组湿疹患儿组64.47±17.23 68.65±16.74*CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%)33.25±11.95 38.83±10.82*29.01±7.93 25.68±6.81*CD4+/CD8+1.24±0.49 1.50±0.60*

2.3 湿疹患者 VDR 、miRNA155、SOCS1 基因的表达 与对照组相比，湿疹患者皮损处VDR 、SOCS1的表达明显下降，miRNA155 的表达明显上升 （P＜0.05），见表2。

表2 湿疹组和对照组 VDR 、miRNA155、SOCS1 表达水平比较（±s）

表2 湿疹组和对照组 VDR 、miRNA155、SOCS1 表达水平比较（±s）

注：与对照组比较 ， *P＜0.05

VDR对照组湿疹患儿组3.62±1.68 1.74±0.92*miRNA155 SOCS1 2.06±0.84 5.41±3.23*3.13± 1.70*1.78±1.02

2.4 湿疹患者血清1，25(OH)2D3浓度与各指标的相关性 湿疹患者血清 1，25 (OH)2D3浓度与 miRNA155 表达呈负相关（P＜0.05）， 与 VDR、SOCS1 表达呈正相关（P＜0.05)，见表3。

表3 湿疹患者血清1，25(OH)2D3 浓度与各指标的相关性

3 讨论

湿疹造成湿疹样皮损，产生剧烈瘙痒，患者焦虑，生活质量下降。 湿疹发病机制复杂，目前认为其病因可能与多种内外因素相关，如自身免疫系统功能失调、慢性皮肤感染、代谢紊乱、化学物质等[5]。 中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、免疫球蛋白和补体都是湿疹重要参与者[6]。

1，25 (OH)2D3属脂溶性类固醇衍生物，是维生素D 家族最重要的成员。 维生素D 可抑制固有免疫及炎症反应，调节皮肤屏障功能，这在湿疹的发病机制中至关重要。 维生素D 可以通过多种途径影响免疫系统的调节。 在针对类风湿关节炎患者的实验中，研究人员发现1，25(OH)2D3可通过调节Th1和 Th17 的平衡，起到免疫调节作用[7]。 此外，研究人员在自身免疫性甲状腺疾病的研究中发现， 抗甲状腺过氧化物酶抗体与血清25-羟基维生素D 之间存在显著的负相关关系。 TPOAb 阳性在维生素D 缺乏者中更为普遍[8]。 活性维生素D 生物活性的表达依赖于维生素D 受体的存在。 研究人员在小鼠湿疹模型的试验中发现，低钙状态VDR 未被激活，使得湿疹的症状明显加重。在经过VDR 激动剂治疗的小鼠皮肤中，有Foxp3 表达的调节T 细胞明显增多，且皮肤屏障基因和抗菌肽基因明显增强[9]。

在皮肤屏障功能方面，维生素D 及其受体可调节基底层的增殖，调控棘层和颗粒层蛋白，并调控角质层脂质的合成[10]。 因此，维生素D 可通过改变表皮屏障功能、免疫失调和细菌防御不足来调节过敏反应。 微小 RNA(microRNA，miRNA)是一类丰富的非编码RNA，由于其调节基因表达的能力，在许多生物过程中起着重要的作用。 多种miRNA 参与调节免疫、自身免疫和预防[9]。 其中，miRNA155 是现有研究中发现的免疫反应的重要调节基因。 许多免疫细胞的刺激可以引起miRNA155 的显著升高[11，12]。 研究发现，在哮喘变化期间，可能通过 miRNA133 和miRNA155 的调节，间充质干细胞，而非条件培养基在减少病理变化中的潜在作用[13]。miRNA155 可上调 T 细胞和 B 细胞的活性[14，15]。 据报道，缺乏miRNA155 的B 细胞反性应降低，不能产生高亲和力的抗体免疫球蛋白（Ig）[16]。 SOCS1 是重要的负性调节因子，在调节性T 细胞的增殖及发挥其功能中起作用，这可阻止自身活性T 细胞的增殖及效应器功能，从而维持自身抗原对外周的耐受性[17]。Treg 细胞中 CD4、CD25 和 Foxp3 的表达为阳性，这是它们发育和发挥功能所必需的。 SOCS1 可阻止Treg 产生炎症细胞因子，在没有SOCS1 的情况下，Tregs 失去Foxp3 的表达，并成为致病性T 细胞[18]。 此外，microRNA-221 通过靶向 SOCS1/NF-κB途径来促进I 型干扰素的产生，从而限制了人类巨细胞病毒（HCMV）的复制[19]。 在小鼠的肺癌模型中研究者证实，MicroRNA-30a 可通过SOCS1 控制诱导型 CD4+Treg 的不稳定性[18]。 而 1，25(OH)2D3可通过 miRNA155-SOCS1 通路负反馈调节 TLR 信号，从而调节机体免疫功能。 2017 年Kempinska-Podhorodecka A 等[20]在对免疫相关性疾病原发性胆汁性胆管炎， 降低VDR 表达可通过miRNA155-SOCS1 通路影响机体免疫功能。

本实验通过检测湿疹及对照组儿童的相应指标发现，湿疹患儿 1， 25(OH)2D3、VDR 明显下降，而miR-155 明显上升，同时伴随 SOCS1 的下降。 提示1，25 (OH)2D3、VDR 可 能 通 过 靶 向 miRNA155-SOCS1 限制炎症反应。 当 1，25(OH)2D3/VDR 不足，将导致其诱导的信号传导受损，诱发免疫炎症的发生。 1，25 (OH)2D3/VDR 的下降， 负反馈调节 miR-155，使其表达上升，而过度表达的 miR-155 造成对 SOCS1 的抑制，使SOCS1 下降。