肺泡灌洗液半乳甘露聚糖试验对慢性阻塞性肺疾病并发侵袭性肺曲霉病的诊断价值及影响因素分析

郭萍，刘洋，魏丹丹，万腊根

（南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006）

侵袭性肺曲霉菌病 (Invasive Pulmonary Aspergillosis，IPA)的发病率近些年来呈现出逐年上升的态势，其主要与目前大量广谱抗菌药物、肿瘤化疗药物、 器官移植术后的免疫抑制剂及糖皮质激素等广泛使用有关，已经逐渐成为影响患者生命安全的重要感染疾病[1]。 过往关于IPA 诊断相关研究多集中于血液病患者，尤其是粒细胞缺乏患者[2]。随着IPA 感染的逐渐播散，越来越多的诊断手段及相关指南中诊断标准的普及推广，IPA 感染在非粒细胞缺乏患者中同样存在高发，且多不像粒细胞缺乏患者症状典型，故常因不能及时有效的诊断而死亡率较高[3]。 传统诊断方法主要以影像学检查、痰涂片、痰培养及血清GM 试验等手段，但这些技术手段在粒细胞缺乏患者上存在一定的敏感性和特异性，而在非粒细胞缺乏患者IPA 的诊断上存在较大的偏差性，造成了IPA 早期诊断困难，严重影响IPA 患者的预后[4]。

随着人口的老龄化，COPD 患者已逐渐成为了社会中的主要群体部分。 而COPD 并发的IPA 感染则直接影响老年人的生命安全。 半乳甘露聚糖（galactomannan，GM） 是存在于曲霉菌细胞壁表面的多糖抗原成分，可在早期感染释放入血液及其他体液标本中，可持续存在1～8 周[5]，因此，其常被看做是早期诊断IPA 感染的有效手段，但随着研究的深入，我们发现血清GM 检测常受到患者的细胞免疫，尤其是中性粒细胞免疫的限制，导致其在非粒细胞缺乏患者IPA 诊断价值十分有限。 支气管肺泡灌洗液（BALF）是利用纤维支气管镜，对肺段和亚肺段进行灌洗后，采集肺泡表面衬液所得。 而已有大量研究及IPA 感染诊治共识表明，BALF-GM检测对IPA 诊断具备较大的诊断价值，却缺乏可靠的实验室诊断标准，因此GM 试验在IPA 感染的诊断价值及其Cutoff 值的设定尚无定论。在COPD 患者并发IPA 感染诊断中的价值更无明确的研究，对其造成的假阳性和假阴性的影响因素也报道较少[6]。 因此本研究通过收集我院非粒细胞缺乏CO PD 患者的疑似 IPA 患者 BALF GM 试验值， 探讨BALF-GM 试验对非粒细胞缺乏患者并发IPA 的诊断价值，并对其造成的假阳性和假阴性的影响因素进行分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取 2016 年 1 月至 2017 年 1 月在南昌大学医学院第一附属医院收治的疑似IPA COPD 患者59 例，排除了粒细胞缺乏、慢性肺曲霉病患者，进行BALF-GM 试验，并收集患者完整的临床病例资料。 基于临床及病理诊断，对59 例患者根据中国肺真菌病诊断和治疗专家共识分为IPA 组和非 IPA 组。 IPA 组 11 例，其中确诊 3 例，临床诊断 8 例，非 IPA 组 48 例。 见图1。

图1 研究流程图：患者的筛选和记录

1.2 研究方法

1.2.1 IPA 的诊断 IPA 诊断标准参照2007 年我国的肺真菌病诊断和治疗专家共识及血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则 （第四次修订版）[7]，分为确诊、临床诊断和拟诊。 确诊：同时具备危险因素、临床特征、微生物学证据及组织病理学证据；临床诊断：符合危险因素、临床特征及微生物学证据， 包括特异性抗原检测阳性或合格的痰标本连续≥2 次分离到曲霉菌； 拟诊：具备危险因素和临床特征，但无微生物学证据者。 由于部分患者过早预防性使用抗真菌药物治疗，存在一定假阴性可能， 故本文我们将临床诊断与拟诊IPA 合并为一组。

1.2.2 GM 试验 采用固相夹心法 ELISA 按照Platelia Aspergillus 试剂盒 (美国 Bio-Rad 公司产品)说明操作，分别将标准液、阳性对照液、阴性对照液及待测液各 300μl 和 100μl 处理液混匀，100℃水浴 3 分钟，10000rpm/min 离心 10min， 取上清50μl 加入 96 孔板中，每孔中加入结合液 50μl 后，封板37℃水浴90min，洗板5 次后，加入显色液200 μl，室温避光 30min 后加入终止液 100μl。 放置酶标仪450 nm 波长处读取各孔的吸光度（OD）值。通过以下公式计算 GM 值：GM 值=OD 待测液/OD 标准液。

1.2.3 假阳性和假阴性的干扰因素 参照文献方法[8]，对临床资料回顾性分析，筛选出引起GM 检测假阳性和假阴性的可能干扰因素。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0 软件，计量资料以±s 表示，采用T 检验或秩和检验。计数资料以百分比表示，采用卡方检验或Fisher 精确检验。 IPA 组和非IPA 组的血清GM 检测值均为非正态分布，采用 Man-Whitney 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。计算BALF-GM 实验的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。 选择ROC 曲线下面积比较BALF-GM 试验的不同临界值，探索最佳临界值。

2 结果

2.1 患者情况临床特征及GM 结果分析 本研究中11 例IPA 患者及48 例非IPA 患者临床特征如表1 所示。 在IPA 组中，肺部基础疾病如肺癌、支气管扩张及肺结核等，肺外基础疾病如糖尿病、高血压、慢性肝炎及肝硬化、风湿性疾病及实体器官肿瘤等及激素治疗均与非IPA 组无显著性差异。

表1 非粒细胞缺乏IPA 患者和非IPA 患者的临床特征及基础疾病

按宿主因素、临床特征、微生物学及组织病理学检查情况分类发现，IPA 组中确诊患者共3 例（27.27%），GM 值中位数为 1.32（0.75～3.64）；临床诊断+拟诊患者 8 例 （72.73%），GM 值中位数为1.395（0.9～12.4）；非 IPA 患者 48 例，GM 值中位数为 0.65（0.50～3.94）。 其中确诊组与临床诊断+拟诊组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。临床诊断+拟诊组与非IPA 组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

BALF 标本下的GM 检测最佳阳性界值 GM试验不同临界值的灵敏度、 特异度、PPV、NPV、AUC 及约登指数见表2。 其中临界值为0.88 时对应的约登指数最高，故设其为BALF-GM 试验最佳临界值。

由表2 及特征性ROC 曲线图3 可知，BALFGM 试验的最佳截断值为0.8，敏感性和特异性分别为90.91%和85.42%，阳性预测值和阴性预测值分别为55.56%和97.56%。 ROC 曲线下面积为0.882（标准误差，0.036，95%置信区间 0.826～0.977），约登指数为0.763。

图2 BALF-GM 实验的受试者工作特征曲线

2.3 BALF 标本GM 实验假阳性和假阴性影响因素分析 以0.88 作为GM 实验的最佳阳性界值，阳性患者共 18 例，假阳性 8 例，真阳性 10 例。 阴性患者共41 例，假阴性 1 例，真阴性 40 例。

在8 例假阳性患者中，2 例患者由隐球菌感染引起，3 例患者因使用半合成类青霉素引起，1 例假阴性结果因检测前使用了抗真菌药物伏立康唑造成。

3 讨论

BALF 即支气管肺泡灌洗液，是向支气管肺泡内注人生理盐水并随即吸出，收集肺泡表面的有效液体，其常作为临床侵入性肺部疾病诊断的有效手段。 侵袭性肺曲霉菌感染因其感染隐匿、进展快、难抑制和高死亡率等特点受到临床重视[9]。 目前针对IPA 感染的诊断多主要集中于粒细胞缺乏感染患者的诊断，而在非粒细胞缺乏患者的诊断上尚存在较大的不足。 目前传统检测方法如痰培养、痰涂片及影像学检查等面临诸耗时长、敏感性差、特异性差等诸多缺点，而血清学检测手段BALF-GM 试验因其直接反映感染病灶而具备较高的特异性与敏感性被广泛使用，尤其是在粒细胞缺乏患者并发IPA 上的诊断价值已被广泛认可[10]，并已纳入了粒细胞缺乏患者的IPA 诊断微生物学标准，然而其在非粒细胞缺乏COPD 患者并发IPA 的诊断中仍有较大争议[11]。

表2 BALF-GM 试验不同临界值的检测结果

血清GM 试验因其曲霉菌侵袭血管内皮细胞生长时才释放入血液，常因细胞免疫而临床使用受限，且容易因临床药物的使用及其他菌种的交叉感染而影响结果[12，13]。 相较而言，BLAF-GM 试验对 I PA 诊断价值的报道越来越多，Meersseman 等[14]研究提示以BALF GM 吸光度指数＞0.5 为阈值，诊断敏感度为88%，特异度为87%。 Shin 等[15]研究也提示BALF GM 敏感度为85%。 本研究结果显示，BALF GM 实验的临界值为0.88 时，敏感性为90.91%，特异性为85.42%，约登指数最大，提示BALF GM 实验以0.88 为临界值时具有最佳临床应用价值。 此时敏感度及特异度较高，ROC 曲线下面积为0.882。 本研究结果显示非粒细胞缺乏COPD 患者并发IPA 多发生在具有支气管炎、 陈旧性肺结核等肺部基础疾病，部分也存在激素治疗史，但与非IPA 感染患者无明显差异，表明BALF-GM 试验诊断价值不受肺部基础疾病的影响。 此外，在肺外基础疾病如糖尿病、高血压、慢性肝炎及肝硬化、风湿性疾病及实体器官肿瘤等两组也无显著性差异，表明BALF-GM 试验对COPD 患者IPA 感染具备较高的诊断价值。

以0.88 为临界值， 对其中的8 例假阳性结果进行分析发现，在假阳性结果中分为感染性因素和非感染性干扰因素，感染性因素由隐球菌交叉反应引起，非感染性因素由使用半合成青霉素复合制剂引起，因此临床上在面对假阳性结果时可从感染与非感染角度进行分析，以提高GM 值在COPD 患者IPA 感染鉴别诊断的应用价值。而1 例假阴性患者在检测前使用了抗真菌药物且有输血史，GM 值明显低于临界值，但由于本次研究数据较少，差异不明显，此结论需扩大数据范围再作分析。

综上所述，本研究选择BALF-GM 值为0.88 作为非粒细胞缺乏COPD 患者并发IPA 感染诊断的最佳临界值，ROC 曲线下面积最大，具有最佳临床应用价值，在此诊断条件下，GM 实验假阳性多由感染性干扰因素和非感染性干扰因素引起， 对其区分有助于临床诊断。