系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中环状RNA has_circ_0044235 的表达及诊断价值研究

聂志文 ，张露 ，罗清 ，万腊根

(1.上海市宝山区吴淞中心医院检验科，上海 宝山 200940；2.南昌大学公共卫生学院，江西 南昌 330006；3.南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌330006)

系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus， SLE）是一种典型的自身免疫性疾病，以多种自身抗体产生、免疫复合物沉积和多器官损伤为特征的慢性系统性自身免疫性疾病[1，2]。 由于 SLE 临床表现多样，且大都数患者早期并无特征性表现，因此根据临床表现对SLE 进行诊断非常困难， 临床上目前仍缺乏理想的SLE 诊断标志物。 因此，迫切需要寻求一种灵敏度高、特异性强、稳定可靠且无创的生物标志物用于SLE 的早期诊断。 环状RNA（Circular RNA， circRNA） 是主要由外显子的转录本组成[3]，是继 microRNA（miRNA）和长链非编码RNA（IncRNA）之后，发现的一种广泛分布在真核细胞胞质中的新型内源性RNA。 它具有闭合环状结构，不受RNA 核酸外切酶的影响，与线性RNA相比，CircRNA 具有显著的非线性特征，无自由3’或 5’端非规范剪接[4]。 与线性 RNA 相比，circRNA更适合作为生物标志物[5，6]。 最近的研究表明，circRNA 在神经系统疾病、 动脉粥样硬化血管疾病、朊蛋白疾病、 癌症和自身免疫性疾病发挥一定作用[7-10]，已成为疾病诊断的新的生物标志物，在SLE中的作用也逐渐得到大家的认识[11]。本研究首次以外周血单个核细胞环状RNA hsa_circ_0044235 为研究目标，探讨其在SLE 中表达以及诊断和鉴别诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 病例资料 ⑴SLE 组： 收集 2016 年 11 月至2018 年8 月期间入住南昌大学第一附属医院75例SLE 患者，SLE 的诊断符合修订后的美国风湿病学会SLE 标准， 并除外患有基础性疾病及其他免疫性疾病者。 ⑵RA 组：收集同期南昌大学第一附属医院住院RA 患者30 例， 所有RA 患者均符合修订的美国风湿病学会RA 标准，并除外患有基础性疾病及其他免疫性疾病者。 ⑶健康对照组：收集同期南昌大学第一附属医院进行体检的健康人58例，所有对象在最近一个月身体健康、未使用任何种类的激素及免疫抑制类药物，无重大疾病史，不具备SLE、RA 诊断标准中的任意一条，且无自身免疫病史。 本研究经南昌大学第一附属医院医学伦理学委员会批准，标本的收取及患者信息的使用已获得患者及家属知情同意，所有患者及志愿者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 逆转录试剂及实时荧光定量PCR 试剂购自日本TaKaRa 公司；Trizol 试剂及荧光定量PCR 引物购自美国赛默飞公司；Ficoll 淋巴细胞分离液购自美国sigma 公司；荧光定量PCR仪北京高端伟业生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理 采集研究对象空腹静脉血5ml，EDTA-K2 抗凝， 按常规方法用 Ficoll 淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞。

1.3.2 总RNA 提取及cDNA 合成向外周血单个核细胞细胞沉淀物中加1.0mlTrizol 试剂， 按试剂说明书提取外周血单个核细胞样本总RNA，DEPC 水溶解。 取1μl 总RNA，按照说明书，利用逆转录试剂盒逆转录为cDNA。

1.3.3 实时荧光定量PCR 采用SYBR 法进行实时荧光定量PCR 检测， 检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书进行。 hsa_circ_0044235 基因上游引物为：5’-TGAGTTTGGTGATTCAGCTTGC-3’， 下游引物为：5’- AACAAGGCTTCTTCTGAGTGT-3’；内参-actin 基因上游引物为：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，下游引物为：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。 反应体系为 20μl，即：2×SYBR PreMix Ex TaqTM Ⅱ10μl、0.5μL 正向引物、0.5μL反向引物、2.0μl 反转录产物、ROX Reference Dye(50×) 0.2μl、ddH2O 6.8μl。 反应条件为： 预变性95℃ 5min，95℃15s，60℃60s，72℃ 120s，40 循环 ，通过溶解曲线检测PCR 产物的特异性。 荧光定量PCR 检测使用StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪进行。 每孔均设3 个表达水平的散点图复孔，取平均CT 值做为该样本最后CT 值，采用β-actin 作为内部对照，用 2-ΔCt 方法分析 hsa_circ_0044235 的相对表达。

1.4 microRNA 预测 基于 TargetScan 和 miRanda的miRNA 靶预测软件预测circRNA/miRNA 相互作用，并对差异表达的circRNA 进行预测，所有的比较都用CircRNA/miRNA 相互作用信息进行了详细的注释。 利用上海生工设计和合成的miRNA 引物，采用实时荧光定量PCR 方法检测SLE 患者和HC PBMC 中候选 CircRNA 的 miRNA 靶标的表达情况。 采用U6 作为内部对照，用2-ΔCt 方法分析miRNA 的相对表达。

1.5 统计学处理 所有数据均使用GraphPad Prism5.0 软件（GraphPad Software，Inc.）和 SPSS17.0版软件 （SPSS，Inc.） 进行统计学分析。 以 Kolmogorov-Smirnov 检验（K-S 检验）对数据进行正态分布检验，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，用 Student’s t 检验或非参数 Mann-Whitney 检验分析两组间hsa_circ_0044235 表达的差异。 采用ANOVA 或Kruskal-Wallis 对三组之间的比较进行统计分析。 最后，采用ROC 曲线及AUC面积评价候选hsa_circ_0044235 对SLE 的诊断价值。 P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组研究对象的临床基本特征 本研究从2016 年 11 月至 2018 年 8 月期间共招募了 75 例SLE 患者，同期招募了同时段 RA 患者 30 例，HC 58例。30 例复诊SLE 患者和20 例HC 被纳入初筛测试集，以检测hsa_circ_0044235 的表达和诊断模型的构建。 此外，45 例 SLE 患者 （13 例初诊），30 例RA 和38 例HC 用于再次验证差异hsa_circ_0044 235 的表达及诊断价值。 见表1。

2.2 外周血单个核细胞环状RNA hsa_circ_0044 235 在SLE 患者中的表达水平 qRT-PCR 结果显示，30 例 SLE 患者的外周血单个核细胞中hsa_circ_0044235 的表达水平明显低于20 例HC，差异有统计学意义（P＜0.0001），见图1。

2.3 外周血单个核细胞环状RNA hsa_circ_0044 235 对SLE 诊断的价值 采用ROC 曲线分析差异表达hsa_circ_004423 对SLE 的诊断价值，结果表明 hsa_circ_0044235 曲线下面积 （AUC） 为 0.873（95%CI：0.778-0.967，P＜0.001），敏感性=70.00%，特异性=100.00%，见图2。

表1 研究对象临床资料特征

图1 外周血单个核细胞环状 RNA hsa_circ_0044235 在SLE 患者中的表达水平

图2 SLE 患者 PBMC 中 circRNA 的 ROC 曲线分析

2.4 验证外周血单个核细胞环状RNAhsa_circ_00 44235 的表达及诊断价值 为了进一步评估hsa_ci rc_0044235 在SLE 中的表达水平及诊断价值，再次检测 45 例 SLE 患者，30 例 RA 和 38 例 HC 外周血单个核细胞中hsa_circ_0044235 表达水平。结果表明，与 RA 和 HC 相比，SLE 患者 hsa_circ_0044235 的水平均明显降低（P＜0.0001）（图3A）。 进一步的ROC 曲线分析表明，SLE 患者和HC hsa_circ_0044235 的 AUC 值为 0.861（95%CI，0.783-0.939;P＜0.001;敏感性= 86.67%;特异性=71.05%)(图3B)。随后为了分析hsa_circ_0044235 对SLE 鉴别诊断的价值，本文就SLE 患者与所有对照组（HC 和RA患者），疾病对照组（RA 患者）进行了ROC 曲线分析。 就 SLE 患者与所有对照组（HC 和 RA 患者）而言，hsa_circ_0044235 的 AUC 为 0.845（95%CI：0.77 4-0.916;P＜0.0001;敏感性=66.4 4%;特异性=89.71%）（图3C），就 SLE 患者和疾病对照组（RA 患者）而言，hsa_circ_0044235 的 AUC 为 0.825 （95%CI，0.734-0.916；P＜0.0001；敏感性=64.44%；特异性=86.67%）见图3D。

图3 差异表达的PBMC circRNA 的诊断价值的双重验证

2.5 与 hsa_circ_0044235 相互作用的 miRNA 为了确定hsa_circ_0044235 的潜在功能，我们通过使用miRanda 软件与MRE 进行比对，预测了hsa_circ_0044235 的潜在miRNA 靶标。确定了3 个假定的miRNA （hsa-miR-892a，hsa-miR-135b-5，hsamiR-135a-5p）。采用 qRT-PCR 检测 SLE 和 HC 外周血单个核细胞中这三个miRNA 表达情况。 结果表明，hsa_circ_0044235 的潜在 miRNA 靶标 hsamiR-135a-5p 和 hsa-miR-135b-5p 表达水平在SLE 患者和HC 外周血单个核细胞中没有明显差异（图4A 和B)，而SLE 患者外周血单个核细胞中hsa_circ_0044235 的潜在 miRNA 靶标 hsa-miR-892a 表达水平明显高于HC，见图4C。

3 讨论

图4 与hsa_circ_0044235 相互作用的miRNA 的表达水平

circRNA 是一类特殊的内源性RNA，可用来作为疾病诊断的新的生物标志物[12]。 李等人[13]描述了SLE 患者血浆中circRNA 的综合表达谱，并开启了circRNA 作为SLE 疾病新的无创生物标志物的研究。 来自Zhang 等人[14]的证据表明，外周血单个核细胞中的circRNA 可能作为SLE 的潜在生物标志物。 此外，我们之前的研究也表明外周血单个核细胞环状RNA hsa_circ_0000479 在SLE 患者中特异性的高表达，且hsa_circ_0000479 表达水平与SLE患者的疾病活动性和治疗相关， 进一步ROC 曲线分析发现 hsa_circ_0000479 的 AUC 大于 0.75，因此hsa_circ_0000479 可作为SLE 的一种潜在的新型分子标志物。

环状 RNA hsa_circ_0044235 位于 17 号染色体，即 17 号染色体 45247282-45259003（负链），被RNA 转录酶Ⅱ转录，其转录本有 350nt。 本课题组之前研究采用芯片检测SLE 患者外周血单个核细胞环状RNA 表达谱显示环状RNA hsa_circ_004 4235 明显下调。 目前尚未见有关环状 RNA hsa_circ_0044235 的研究报道。 为了探讨 PBMC 中下调的hsa_circ_0044235 是否可作为SLE 的诊断生物标志物，本研究通过初步验证和双重验证来证实。 初步验证结果表明，hsa_circ_0044235 的AUC值为0.873。 双重验证结果显示，这些circRNA 在区分SLE 患者和HC 时产生的AUC 值与初步验证结果相似， 表明外周血单个核细胞中下调的hsa_circ_0044235 对 SLE 有潜在的诊断价值。 此外，本文对hsa_circ_0044235 在区分SLE 和其他自身免疫性疾病（RA）方面的效果进行了评估，研究结果显示 hsa_circ_0044235 可有效区分 SLE 患者和RA 患者。

越来越多的证据表明，circRNA 可能通过与目标miRNAs 结合来发挥生物学功能。 李等人[15]研究表明hsa_circ_0045272 可通过直接结合miR-6127在SLE 发病机制中起着重要作用。 本研究通过初步验证和双重验证证实SLE 患者外周血单个核细胞中的hsa_circ_0044235 明显下调。为了探讨下调的hsa_circ_0044235 在SLE 中的潜在作用，本研究采用生物信息学方法对差异表达circRNA 的潜在的mi RNAs 靶标进行了预测，分别获得了 hsa_circ _0044235 的 3 种可能mi RNAs 靶标。 我们检测和比较了SLE 患者和HC PBMC 中这些预测的mi RNAs 靶标的表达水平。 结果显示，SLE 患者外周血单个核细胞中hsa -miR -892a 水 平 明 显 升 高 ， 提 示hsa_circ_0044235 可能通过与 hsa-miR-892-a 相互作用而在 SLE 中发挥作用。 然而，hsa_circ_0044235 在SLE 中的确切机制需要进一步研究。

综上所述，SLE 患者外周血单个核细胞环状RNA hsa_circ_0044235 的表达明显下调，可能作为SLE 的潜在诊断及鉴别诊断标志物。 且环状RNA hsa_circ_0044235 可能通过与 hsa-miR-892-a 相互作用而在SLE 中发挥作用。