电针对AD 模型大鼠学习记忆功能、GRIP1、GRIP2蛋白的影响

黄文甫，白小利

（洛阳市第一人民医院神经内科，河南 洛阳471000）

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的病理学特征主要为是细胞外β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉积所致的老年斑(senile plaque，SP)，细胞内神经元、轴突缺损，以及神经元纤维缠结[1]。AD 是常见于老年人的中枢神经系统退行性疾病，会引起患者老年痴呆，精神行为异常、生活能力下降、记忆力衰退等[2]。

单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1，MCP-1) 可通过作用炎症网络的起始因子，并诱导炎症，介导其他炎性介质释放，促进炎症发生、发展[3]。 血清中基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1） 则具有促星型胶质细胞合成谷氨酸， 并诱导胶质细胞突触传递及神经元的兴奋等功能[4]。 谷氨酸受体相互作用蛋白(glutamate receptor interacting protein，GRIP) 在 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙 (α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4 -isoxazole propionate， AMPA)受体在突触后膜的锚定中起重要作用[5]。

现今对其治疗临床缺乏有效的治疗手段和特效药物，针灸则较多的用于AD 的治疗。 由于其有多靶点、多途径、多层面的优势，治疗AD 具有较好的效果。

本研究通过构建AD 模型大鼠，研究电针对大鼠的记忆功能的影响及海马组织中GRIP1、GRIP2蛋白、血清SDF-1 水平、MCP-1 水平的变化意义，报告如下。

1 实验动物与方法

1.1 实验动物 选取成年雄性SD 大鼠48 只（SPF级），平均体质量 250g±20.0g，喂养于光照间隔 12h、自由进食进水、相对湿度45%～60%、室温22℃～25℃的环境中。

1.2 实验仪器与药品 Aβ1-40 购自美国Sigma 公司，Morris 水迷宫、Y 型水迷宫由江苏赛昂斯生物科技有限公司提供，微量注射器购自北京英伟达科技有限公司，脑立体定位仪(江湾I 型)为第二军医大学生理教研室研制，针灸针、电针治疗仪购自河南翔宇医疗设备股份有限公司，ELISA 试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司。

1.3 造模方法 AD 大鼠造模方法为双侧海马区微量Aβ 注射法:给予大鼠腹腔水合氯醛麻醉后，固定大鼠头部，清理手术区皮肤，消毒后正中切口，显露前囟，向后3.4mm、旁开1.8mm 进行钻孔操作，设置2 个对称孔后，选用1ul Aβ1-4 缓慢注射，完毕后停针5.0min，选用明胶海封闭钻孔，缝合皮肤，并给予大鼠8 万U 青霉素肌注，持续3d。 假手术组给予同剂量生理盐水注射操作。

1.4 干预方法 实验组：异戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，按实验动物大鼠穴位图谱取肾俞穴，用30号13mm 不锈钢毫针平刺5mm， 双侧肾俞直刺约4.5mm；百会穴平刺约3mm。

电针治疗仪操作如下:实验动物大鼠穴位图谱[频率为20Hz 的连续波，强度控制以大鼠可安静耐受为准。每日进行一次针刺治疗，每次持续30min，持续 4～5 周。

除实验组外，其余各组正常饲养，但保证其与实验组治疗时的姿势相同，但是不予针刺治疗。

1.5 指标检测方法

1.5.1 Morri 水迷宫实验 大鼠均行给予Morris 水迷宫试验，实验持续5d，记录每d 各组大鼠的逃避潜伏期。5d 后撤去中央平台，随机将大鼠放于水中，测试各组大鼠760s 内跨越原平台位置的次数及在原象限停留时间[4]。

1.5.2 免疫组化染色 取大鼠一侧海马浸入4%中性缓冲甲醛中，浸泡外固定24h，对海马标本进行冠状切片，片厚5um，乙醇脱水-二甲苯透明-浸蜡及石蜡包埋后，连续切片，后贴片，将附贴好的切片放置在恒温箱内1.5h， 取出后进行亚甲蓝和HE 染色。

1.5.3 ELISA 法 在水迷宫试验后， 断头处死大鼠后迅速取海马组织，提取海马组织中的总蛋白采用ELISA 加入不同的抗体检测 GRIP1、GRIP2、SDF-1、MCP-1 水平。

2 结果

2.1 各组大鼠的行为学改变 模型组大鼠的平台搜寻时间显著的长于空白组和假手术组（P＜0.05），模型组大鼠的第二象限活动时间、 跨越平台次数均显著的低于空白组和假手术组（P＜0.05）；实验组的平台搜寻时间显著低于空白组（P＜0.05），实验组的第二象限活动时间、 跨越平台次数显著高于空白组（P＜0.05）。 见表1。

2.2 各组大鼠的大鼠海马组织中GRIP1、GRIP2 蛋白表达比较 模型组大鼠的大鼠海马组织中GRIP1、GRIP2 蛋白表达水平低于空白组和假手术组（P＜0.05）；实验组的大鼠海马组织中 GRIP1、GR IP2 蛋白表达水平显著高于空白组（P＜0.05）。 见表2、图1、图2。

表1 各组大鼠的行为学改变（±s）

表1 各组大鼠的行为学改变（±s）

组别 n 平台搜寻时间（s）第二象限活动时间（s）空白组假手术组模型组实验组F 值P 值12 12 12 12 29.6±1.7 29.9±2.0 39.8±2.8 33.0±2.5 11.628＜0.001 13.5±3.0 13.1±2.6 7.5±2.0 11.1±2.3 7.584 0.001跨越平台次数（次）1.35±0.33 1.26±0.26 0.63±0.22 1.04±0.25 8.007＜0.001

表2 各组大鼠海马组织中GRIP1、GRIP2 蛋白表达水平比较（±s，IOD）

表2 各组大鼠海马组织中GRIP1、GRIP2 蛋白表达水平比较（±s，IOD）

组别 n空白组假手术组模型组实验组F 值P 值12 12 12 12 GRIP1 蛋白 GRIP2 蛋白169.3±20.5 173.5±19.6 47.3±8.1 100.7±16.4 28.858＜0.001 155.8±24.1 149.4±21.8 50.2±9.7 110.5±18.9 31.175＜0.001

图1 四组大鼠海马组织中的GRIP1 蛋白免疫组化染色，A为空白组、B 为假手术组、C 为模型组、D 为实验组，（200 倍）

2.3 各组大鼠的大鼠血清MCP-1、SDF-1 水平比较 模型组大鼠的血清MCP-1 水平高于空白组和假手术组（P＜0.05），模型组大鼠的血清 SDF-1 水平显著的低于空白组和假手术组（P＜0.05）；实验组的血清 MCP-1 水平低于空白组（P＜0.05），实验组的血清 SDF-1 水平高于空白组（P＜0.05）。 见表3。

图2 四组大鼠海马组织中的GRIP2 蛋白免疫组化染色，A为空白组、B 为假手术组、C 为模型组、D 为实验组，（200 倍）

表3 各组大鼠血清 MCP-1、SDF-1 水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清 MCP-1、SDF-1 水平比较（±s）

组别 n空白组假手术组模型组实验组F 值P 值12 12 12 12 MCP-1（ng/L） SDF-1（ng/L）124.2±5.6 125.0±7.1 144.9±8.0 131.7±6.7 15.694＜0.001 115.8±7.4 113.4±9.0 98.0±8.1 107.6±7.8 20.428＜0.001

3 讨论

阿尔茨海默属于中医的健忘、痴呆的范畴，患病的患者肝肾不足、脑髓不充或年迈体虚；或脑神失养、脾肾气血不足导致[6，7]。 百会穴主健忘、失眠，肾俞穴主耳聋肾虚、虚劳赢瘦，两者联合使用能够起到补肾填精、气血得养、髓海得充、开窍醒神的作用[8]。 本实验结果显示，模型组大鼠的平台搜寻时间显著的长于空白组和假手术组（P＜0.05），模型组大鼠的第二象限活动时间、跨越平台次数均显著的低于空白组和假手术组（P＜0.05）；实验组的平台搜寻时间显著低于空白组（P＜0.05），实验组的第二象限活动时间、跨越平台次数显著高于空白组（P＜0.05），表明大鼠经电针治疗后，能够显著缩短奥比潜伏期的时间，原象限平台停留时间和穿越原象限平台的次数明显增高，提示电针可有效增强AD 大鼠的学习、记忆能力。

趋化因子在与相应的受体作用，可诱导星型胶质细胞、小胶质细胞等细胞活化，并介导炎症反应及部分神经的毒性或保护效应， 最终参与AD 发生、发展[9]。与此同时，AD 患者本身也存在某些趋化因子以此表达情况， 这也将促使患者SDF-1 低表达和 MCP-1 表达显著上升[10，11]。

本研究结果显示， 模型组大鼠的血清MCP-1水平高于空白组和假手术组， 血清SDF-1 水平显著的低于空白组和假手术组；实验组的血清MCP-1 水平低于空白组，血清SDF-1 水平高于空白组，表明电针能够降低AD 大鼠血清MCP-1 水平，提高血清SDF-1， 可能由于在电针治疗后能够降低MCP-1 等趋化因子的表达水平， 从而阻止大鼠血清和脑组织中的炎症反映水平，从而起到保护脑组织的作用; 由于SDF-1 在调节学习记忆功能中具有重要作用，其可诱导星形胶质细胞合成谷氨酸，并以此增强神经细胞兴奋性，活化整个胶质细胞信号网络的传递功能；SDF-1 还可保护组织神经元，避免神经元被β 淀粉样蛋白沉积而损伤， 从而达到保护神经元的目的，上调SDF-1 的表达水平，可能与提高大鼠的学习记忆功能具有一定的相关性。

AMPA 受体随着神经元的活动不断从在细胞质与细胞膜之间进行循环运动，突触后膜上该受体的数目决定神经元的兴奋度，决定中枢神经系统影响突触可塑性的程度[12，13]。 GRIP 在 AMPA 受体的插膜过程中起着重要作用，GRIP1、GRIP2， 通过与AMPA 受体亚基GluR2 及GluR3 的C 末端相互作用，从而调节AMPA 受体亚基在细胞膜和突触后膜上的分布情况，能够增强AMPA 受体在突触后膜的聚集分布的稳定性，从而调节突触的可塑性[14，15]。

本研究结果显示，模型组大鼠的大鼠海马组织中GRIP1、GRIP2 蛋白表达水平低于空白组和假手术组; 实验组的大鼠海马组织中GRIP1、GRIP2 蛋白表达水平显著高于空白组，表明，电针刺激后会增强大鼠海马组织中GRIP1、GRIP2 蛋白表达水平，从而增强AMPA 受体亚基在突触后膜的稳定程度和数目，促使突触后神经元的兴奋化，最终增强大鼠的学习、记忆能力。

综上所述， 本研究通过电针刺激AD 大鼠后，观察其学习记忆能力的变化，并分析血清SDF-1、MCP-1 和海马组织 GRIP1、GRIP2 蛋白表达水平的变化，表明电针能够通过改变血清趋化因子的表达水平、 调节脑海马区域神经元兴奋相关蛋白表达水平，进而增强大鼠的学习、记忆能力，对临床治疗AD 具有一定的指导作用。