转基因大豆油对低营养模型小鼠免疫功能的影响

吴争，夏芝璐，雷达

（江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029）

大豆油是日常饮食中一种常见的烹调用油，在提供人体能量和必需脂肪酸方面起着重要作用。 由于转基因大豆成本低出油率高，转基因大豆油已经占据国内主要食用油市场，转基因大豆油也成为我国消费者最易获取的转基因食品，对其进行安全性的评估显得尤为重要。 我国和亚洲大多数国家一样，国民都选择以碳水化合物（谷类、豆类）为主食[1]，虽然随着经济和科技的发展，国民的膳食营养结构得到持续不断的改善，但低收入人群的日常饮食中仍然存在以素食为主、 碳水化合物比例高[2]、缺乏优质的动物性蛋白等营养不均衡的问题[3]，饮食结构不合理是造成机体患重大疾病的风险因素[4]。 由于低收入人群通常在选择食用油时更倾向选择价格低廉的转基因大豆油，为了解转基因大豆油是否会进一步增加这一类人群健康风险，本次研究通过建立动物模型模拟特殊人群的健康状况，并观察了转基因大豆油对动物模型免疫功能的影响，报告如下。

1 仪器与材料

1.1 受试物 本次实验所用转基因大豆油、非转基因大豆油均从大型超市购得。

1.2 实验动物 本实验室选用的SPF 级ICR 小鼠。由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供， 并由该公司提供全价标准小鼠生长饲料和造模用低营养小鼠饲料（蛋白质含量9%、粗脂肪含量3%）。 实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2011-0003；

1.3 仪器和试剂 显微镜、生物安全柜、冷冻离心机、电子天平、721 分光光度计、酶标仪、CO2培养箱、DNFB(二硝基氟苯)、1640 完全培养基、刀豆蛋白A（ConA）、无菌脱纤维绵羊红细胞、无菌脱纤维鸡红细胞、印度墨汁。

2 方法

试验方法参照 《保健食品检验与评价技术规范2003 年版》中功能学评价部分[5]进行。

2.1 动物模型和剂量分组 取体重范围18～20g 的ICR 雌性小鼠，使用低营养小鼠饲料喂养建立模型，7 天后，按体重随机分组。 将模型动物分为五个实验大组， 每实验大组设置转基因大豆油低、 中、高三个剂量组，按人群可能日摄入量[6]的 5、10、20 倍即 3.6、7.2、14.4g/kgBW，给予转基因大豆油;设置一个非转基因大豆油组按14.4g /kgBW 给予非转基因大豆油；设置一个模型对照组，给予蒸馏水；模型动物分组后继续使用低营养饲料喂养;另选用同批次购买的使用全价标准饲料喂养的小鼠设置一个正常对照组，给予蒸馏水；各剂量组动物数均为10 只。 小鼠连续灌胃30 天后开始试验。 免疫实验一组进行迟发型变态反应实验； 免疫实验二组进行碳廓清实验； 免疫实验三组进行淋巴器官/体重比值测定和ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK 细胞活性测定; 免疫实验四组进行血清溶血素的测定和抗体生成细胞检测;免疫实验五组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。

2.2 实验步骤

2.2.1 脏器/体重比值测定[5]试验 处死动物，取小鼠胸腺、 脾脏， 称量后计算脏器/体重比即脏器指数，计算公式如下：

2.2.2 迟发变态反应试验[5]DNFB 致敏，攻击，诱导小鼠DTH，测定鼠耳肿胀程度。

2.2.3 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验[5]（MTT法） 处死动物，取脾脏制成脾细胞悬液，经过增殖后，按MTT 法，在570 nm 处比色测定，比较加与不加ConA 的光密度值之差，作统计处理。

2.2.4 血清溶血素试验[5]取全血分离血清，按血凝法观察绵羊红细胞凝集程度，计算抗体积数。

2.2.5 抗体生成细胞试验[5]用脱纤维绵羊红细胞免疫实验动物4～5 天后，处死，取脾脏制成脾细胞悬液，Jerne 改良玻片法，计数溶血空斑数。

2.2.6 小鼠碳廓清试验[5]小鼠尾静脉注射1∶4 稀释的印度墨汁，注入后立即计时，分别于2、10 min时从眼静脉丛中取血20μl 并将其加入Na2CO3溶液，用分光光度计在600 nm 波长处测光密度值。以Na2CO3溶液作空白对照， 根据动物体重和脾重计算吞噬指数。

2.2.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验[5]每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1ml，间隔30min 颈椎脱臼处死，固定于鼠板上，剪开腹壁皮肤，注射生理盐水2mL，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1ml，分滴于 2 片玻片上，37℃孵箱 30min， 用生理盐水漂洗、晾干，以丙酮+甲醇(1+1)固定，4%Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再以蒸馏水漂洗晾干，用油镜镜检，计算吞噬百分率和吞噬指数。

2.2.8 NK 细胞活性测定[5]取脾脏，制成细胞悬液，按乳酸脱氢酶(LDH)法，用酶标仪在490 nm 处测定光密度值A。

2.3 统计方法 数据经Excel 建立数据库， 计算均数和标准差（以±s 表示），用 spss 统计软件进行单因素方差分析（ANOVA），以 α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 动物模型一般状况 动物模型在给予低营养饲料造模期间，体重增长缓慢；实验初、中、末期及总体重增长显著低于正常对照组动物； 同时个别动物出现毛发枯槁、疏松、畏寒、反应迟顿等表现。

3.2 转基因大豆油对模型动物体重的影响 见表1，模型对照组各周体重及总体重增长均低于正常对照组，差异有显著性（P＜0.05）。 各剂量组动物实验初期体重与模型对照组比较无差异（P＞0.05）；由图1 和表1 可见转基因高剂量组、非转基因组在第三、四周的体重以及总体重增长高于模型对照组，差异有显著性（P＜0.05）；其他各剂量组各周体重及总体重增长与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 实验期间各剂量组动物体重(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较(P＜0.05)，差异有统计学意义 * 表示与模型对照组比较(P＜0.05)， 差异有统计学意义

剂量分组 初重(g) 第一周(g) 第二周(g) 第三周(g) 第四周(g) 增重(g)转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组20.3±0.7 20.3±1.0 20.6±0.8 20.7±1.2△20.6±1.1 25.2±0.8 21.9±0.8 21.7±1.2 21.9±0.6 21.6±0.9△22.2±0.8 26.6±0.6 23.5±1.0 23.3±1.7 23.1±1.1 23.2±1.2△23.5±1.1 28.0±1.0 26.4±0.7*25.2±1.1 25.0±1.1 25.0±1.3△26.6±0.5*32.1±1.3 29.6±0.9*28.4±1.8 28.1±1.3 28.2±1.7△30.0±1.6*34.7±1.3 9.32±1.0*8.11±1.4 7.45±1.6 7.54±1.7△9.38±1.8*9.49±1.5

图1 实验期间受试物对各剂量组动物体重的影响

3.3 转基因大豆油对模型动物淋巴器官/体重比值的影响 模型对照组脾脏、胸腺重量、胸腺/体重比值和脾脏/体重比值均低于正常对照组， 差异有显著性（P＜0.01）；转基因高剂量组、非转基因组胸腺重量、胸腺/体重比值高于模型对照组，差异有显著性（P＜0.05）。其他各剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。

3.4 转基因大豆油小鼠迟发型变态反应试验结果各剂量组对DNFB 所致小鼠耳廓迟发变态反应的影响， 模型对照组小鼠耳廓肿胀度低于正常对照组，差异有显著性（P＜0.01）；转基因高剂量组、非转基因组小鼠耳廓肿胀度与模型对照组比较， 有显著增加（P＜0.01）；其他剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。

表3 转基因大豆油对小鼠迟发型变态反应试验的影响(±s，n=10)

表3 转基因大豆油对小鼠迟发型变态反应试验的影响(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较(P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义 * 表示与模型对照组比较(P＜0.05)，** 表示与模型对照组比较(P＜0.01) 差异有统计学意义

剂量分组 DNFB 诱导DTH 左右耳重量差(mg)转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组7.70 ±1.16**4.90 ±0.99 4.60 ±1.26 4.40 ±1.07△△7.30 ±0.67**8.70 ±0.67

3.5 转基因大豆油脾淋巴细胞转化试验结果 模型对照组淋巴细胞转化能力低于正常对照组，差异有显著性（P＜0.01）；转基因高剂量组、非转基因组淋巴细胞转化能力与模型对照组比较， 有显著提高（P＜0.01）；其他剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表4。

3.6 转基因大豆油小鼠血清溶血素试验结果 模型对照组溶血素滴度水平低于正常对照组，差异有显著性（P＜0.01）；其他剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表5。

3.7 转基因大豆油抗体生成细胞试验结果 模型对照组抗体生成细胞数低于正常对照组， 差异有显著性（P＜0.01）；其他剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表6。

表2 转基因大豆油对模型动物淋巴器官/体重比值的影响(±s，n=10)

表2 转基因大豆油对模型动物淋巴器官/体重比值的影响(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较(P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义 * 表示与模型对照组比较(P＜0.05)，** 表示与模型对照组比较(P＜0.01) 差异有统计学意义

0.099 ±0.013 0.092 ±0.017 0.089 ±0.011 0.090 ±0.012△△0.100 ±0.015 0.169 ±0.046剂量分组 脾重(g)转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组胸腺重(g) 脾体比%0.086 ±0.010*0.074 ±0.017 0.073 ±0.014 0.070 ±0.016△△0.088 ±0.010**0.109 ±0.013 3.32 ±0.41 3.20 ±0.41 3.15 ±0.29 3.16 ±0.29△△3.32 ±0.37 4.86 ±1.18胸体比%2.900 ±0.290*2.601 ±0.478 2.575 ±0.428 2.467 ±0.516△△2.934 ±0.256*3.140 ±0.283

表4 转基因大豆油对ConA 诱导脾淋巴细胞增殖的影响(±s，n=10)

表4 转基因大豆油对ConA 诱导脾淋巴细胞增殖的影响(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较 (P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义 * 表示与模型对照组比较(P＜0.05)，** 表示与模型对照组比较(P＜0.01) 差异有统计学意义

剂量分组 ConA 诱导脾淋巴细胞增殖OD 差值转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组0.186 ±0.054**0.130 ±0.080 0.126 ±0.076 0.119 ±0.045△△0.193 ±0.066**0.277 ±0.089

表5 转基因大豆油对小鼠溶血素滴度水平的影响(±s，n=10)

表5 转基因大豆油对小鼠溶血素滴度水平的影响(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较 (P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义

163.600 ±12.63 161.500 ±16.17 153.400 ±10.42 159.100 ±17.23△△165.800 ±9.68 224.700 ±24.98剂量分组 血清溶血素(抗体积数)转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组

表6 转基因大豆油对抗体生成细胞的影响(±s，n=10)

表6 转基因大豆油对抗体生成细胞的影响(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较 (P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义

927.5 ±300.2 952.5 ±393.2 935.0 ±300.5 925.5 ±335.3△△983.5 ±293.1 1951.0 ±648.8剂量分组 溶血空斑数(/106 脾细胞)转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组

3.8 转基因大豆油小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果 模型对照组巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力低于正常对照组，差异有显著性（P＜0.01）；非转基因组巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力高于模型对照组，差异有显著性（P＜0.01）；其他剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表7。

3.9 转基因大豆油小鼠碳廓清试验结果 模型对照组碳廓清能力低于正常对照组， 差异有显著性（P＜0.01）； 非转基因组碳廓清能力高于模型对照组，差异有显著性（P＜0.01）；其他剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表8。

3.10 转基因大豆油NK 细胞活性试验结果 模型对照组NK 细胞活性低于正常对照组，差异有显著性（P＜0.01）；非转基因组NK 细胞活性高于模型对照组，差异有显著性（P＜0.01）；其他剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表9。

表7 转基因大豆油对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响(±s，n=10)

表7 转基因大豆油对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响(±s，n=10)

注：△表示与正常对照组比较(P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义 * 表示与模型对照组比较(P＜0.05)，** 表示与模型对照组比较(P＜0.01) 差异有统计学意义

剂量分组转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组吞噬百分率（%）28.44 ±2.16 27.43 ±2.42 28.13 ±1.60 26.93 ±2.84△△32.64 ±1.46**50.76 ±2.77吞噬指数0.14 ±0.03 0.12 ±0.03 0.14 ±0.03 0.12 ±0.02△△0.18 ±0.03**0.31 ±0.03

表8 转基因大豆油对碳廓清的影响(±s，n=10)

表8 转基因大豆油对碳廓清的影响(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较 (P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义 * 表示与模型对照组比较(P＜0.05)，** 表示与模型对照组比较(P＜0.01) 差异有统计学意义

5.61 ±0.56 5.23 ±0.65 5.37 ±0.41 5.29 ±0.46△△6.90 ±0.44**7.24 ±0.50剂量分组 碳廓清吞噬指数转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组

表9 转基因大豆油对NK 细胞活性的影响(±s，n=10)

表9 转基因大豆油对NK 细胞活性的影响(±s，n=10)

注：△ 表示与正常对照组比较 (P＜0.05)，△△表示与正常对照组比较(P＜0.01)，差异有统计学意义 * 表示与模型对照组比较(P＜0.05)，** 表示与模型对照组比较(P＜0.01) 差异有统计学意义

53.46 ±4.79 53.89 ±7.46 50.49 ±8.29 49.96 ±9.11△△63.51 ±9.03**73.93 ±7.07剂量分组 NK 细胞活性(%)转基因高剂量转基因中剂量转基因低剂量模型对照组非转基因组正常对照组

4 讨论

目前国际上对转基因食品安全风险评估，大多采纳由欧洲经济发展组织（OECD）提出的“实质等同”原则，即转基因食品成分与现有的传统食物成分大体等同，那么它们就被视为具有等同的安全性。 而该原则从其颁布之始，就因实验数据不足等科学方法缺陷备受争论[7，8]。国内有学者指出在传统毒理学方法评价转基因食品的过程中，使用处在快速生长期的健康实验动物，不能代表整体人群的健康状况；喂养实验动物的AIN-93 标准配方饲料，属于高营养饲料，其营养水平（蛋白含量达20%）高于人类普遍营养水平； 高营养水平一方面促进了机体的解毒效应，另一方面使受试物营养缺陷等负面效应也被掩盖[9]。 龙伟等[10]将转基因和非转基因大豆油分别给予使用纯玉米饲养的小鼠，结果显示转基因大豆油组小鼠免疫器官指数均低于非转基因大豆油组，但该研究并未报道受试动物具体免疫功能的改变。

为了评估转基因大豆油对特殊人群免疫功能的影响，本次研究使用特定的低营养配方饲料建立动物模型，由表1～9 可见实验期间模型对照组体重增长明显低于正常对照组；除了一般表现外，模型对照组小鼠在实验末期脏器指数、细胞免疫功能、体液免疫功能、 巨噬细胞吞噬功能、NK 细胞活性均低于正常对照组（P＜0.01），符合因营养不良[11]引起免疫力下降的特征，因此动物模型成立。

本次实验结果显示，转基因大豆油高剂量组末期体重、总体重增长、胸腺指数均高于模型对照组（P＜0.05），因此提示高剂量组受试对动物胸腺有营养支持作用。 通过迟发变态反应试验和淋巴细胞转化试验检测了各剂量组动物的细胞免疫功能，由表3、4 可见转基因大豆油高剂量组迟发变态反应和淋巴细胞转化能力均高于模型对照组 （P＜0.01）， 提示高剂量组受试物对细胞免疫功能有促进作用。

由于在前期预实验中观察到部分高剂量组受试动物出现大便稀溏现象，而中、低剂量未出现此情况，所以我们在正式实验中设置了非转基因大豆油组，灌胃容量参照转基因大豆油高剂量组，将实验结果和模型对照组比较，以此排除大豆油本身对试验的不良影响;我们观察到非转基大豆油组同样具有提高胸腺指数和促进细胞免疫的作用(见表1-4），同时由表7～9 可见，非转基大豆油组巨噬细胞吞噬功能[12]和NK 细胞活性[13]均高于模型对照组，差异有显著性（P＜0.01）；NK 细胞活力和单核细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要指标，提示非转基大豆油组动物的非特异性免疫功能也有提升。

胸腺是T 淋巴细胞增殖和分化的场所[14]，胸腺微环境也是T 淋巴细胞选择性发育的重要条件。 T淋巴细胞中的Th1、Th2 亚群都是迟发型变态反应的效应 T 细胞， 同时 Th1 亚群还分泌 IFN-r、IL-2等细胞因子增强细胞介导的抗感染免疫，IFN-r 可增强巨噬细胞的吞噬功能，IFN-r、IL-2 可增强NK细胞的活性。 综合以上实验结果，我们认为转基因大豆油和非转基因大豆油都对受试动物胸腺有营养支持作用，对受试动物的细胞免疫功能都能起到一定促进作用，但非转基因大豆油效果更好；本次研究未观察到转基因大豆油对受试动物其它免疫功能产生不良影响。

近年来我国对转基因食品加大监管力度[15-17]，但消费者的疑虑、反对声一直不断[18，19]，世界卫生组织（WHO）也认为，国际上生物安全方面的评估技术尚不成熟，研究更加严谨科学的评价方法是消除公众疑虑及促进转基因事业健康发展的关键所在。 本次研究建立了低营养水平动物模型，该造模方法与传统腹腔注射免疫抑制剂[20]建立动物模型相比具有：操作简单、重复性好、减少动物机会感染等优点，能更好地模拟现实生活中特殊人群的实际情况。 本次研究为评价转基因大豆油对免疫系统的营养效应以及指导人群合理食用提供了实验参考数据;为科研人员更安全地开发转基因产品提供了新的思路。