罗氏沼虾低温有水保活试验

2020-11-10杨丰吴涵王逸鑫李念施文正汪之和

湖南农业大学学报（自然科学版） 2020年5期

杨丰，吴涵，王逸鑫，李念，施文正,2，汪之和,2,3*

罗氏沼虾低温有水保活试验

杨丰1，吴涵1，王逸鑫1，李念1，施文正1,2，汪之和1,2,3*

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海)，上海 201306；3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306)

通过对保活温度(12、15、17、20、23、25 ℃)，虾与水质量比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15)和暂养时间(0、12、24、36、48 h) 3个因素的单因素试验和正交试验，确定罗氏沼虾低温保活的最佳工艺条件，并检测低温保活过程中的水质指标及肌肉、血液、肝脏等虾体组织指标的变化，探究影响罗氏沼虾的保活机理。结果表明：罗氏沼虾的临界温度为9 ℃；单因素试验中，最佳保活温度为20 ℃，最佳虾与水质量比为1∶10，最佳暂养时间为24 h；正交试验中，最优工艺为保活温度20 ℃、虾与水质量比1∶12、暂养时间24 h，保活24 h内存活率可达100%；以正交优化后的最优工艺条件进行罗氏沼虾的低温保活试验，水样中氨氮质量浓度和菌落总数显著上升(＜0.05)，但溶解氧质量浓度、pH均仍在适宜罗氏沼虾存活范围内变化，肌肉糖原质量分数、pH和三磷酸腺苷(ATP)质量分数下降，乳酸浓度显著上升(＜0.05)，血液谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活力显著上升(＜0.05)，肝脏糖原质量分数显著下降(＜0.05)，总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力先降后升，而丙二醛(MDA)含量则先升后降。说明水质指标的变化会影响虾体肌肉、血液及肝脏各组织正常的生理代谢，从而影响其保活时间和存活率。

罗氏沼虾；有水保活；低温保活；保活温度；暂养时间；保活时间；存活率

水产品因其富含优质蛋白且味道鲜美，广受大众喜爱。随着人们生活品质的提高，广大消费者对水产品的要求逐步从“有的吃”转变到“吃得好”，对鲜活水产品的保活运输也提出了更高的要求[1-2]。水产品常用的保活方法有净水法、增氧法、麻醉法、低温法等。低温法因其健康绿色、操作简便、成本低廉而深受青睐。

目前，对低温保活的研究主要集中于鱼类，对虾类的保活，尤其对中国四大淡水虾之一的罗氏沼虾的保活研究报道极少。SALIN[3]和COYLE等[4]分别研究了不同降温速率和温度对罗氏沼虾存活的影响，证实通过一定的降温速率和温度控制可提高罗氏沼虾的存活率。鉴于此，本研究中，采用低温有水保活法，研究罗氏沼虾受不同暂养时间、水温、虾与水质量比(后简称“虾水比”)等因素影响下的水质环境变化及虾体生理变化，探究影响罗氏沼虾的保活机理，以期为罗氏沼虾的保活提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

供试罗氏沼虾购于上海市浦东新区农贸市场。虾体质量20～30 g，体长10～15 cm。试验用水为经过24 h以上充分曝气的自来水。水质相关指标为：pH值7.87、溶解氧质量浓度8.20 mg/L、氨氮质量浓度0.17 mg/L、菌落总数7.24 cfu/mL。

1.2　临界温度的测定

临界温度又称生态冰温零点，是区分鱼、虾、贝类等水产品生死的参考值点[5]。将经过暂养12 h的罗氏沼虾放入经充分曝气的清洁自来水的鱼箱中，利用冰袋降温。降温程序为：当水温＞20 ℃时，降温速率为4～5 ℃/h；当水温16～20 ℃时，降温速率为2～3 ℃/h；当水温＜16 ℃时，降温速率为1～2 ℃/h。观察罗氏沼虾在不同温度条件下的行为状态，以所有步足丧失活动能力、虾体侧躺水底、对外界的刺激无反应(虾体尚未死亡)的温度作为其临界温度。

1.3　罗氏沼虾低温保活工艺优化试验

1.3.1单因素试验

分别对保活温度、虾水比和暂养时间3个因素进行单因素试验。

选择健康鲜活、个体大小一致的罗氏沼虾暂养12 h后，以虾水比为1∶10，分别在12、15、17、20、23、25 ℃条件下进行保活温度试验，在保活4、10、17、24、32、40、48 h时检活，记录和计算存活率。

选择最佳保活温度，将暂养12 h后的罗氏沼虾分别放入不同的虾水比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15)的保活箱中进行试验，在保活4、10、17、24、32、40、48 h时检活，记录和计算存活率。

选择最佳的保活温度和虾水比，分别将暂养0、12、24、36、48 h后的罗氏沼虾进行试验，在保活4、10、17、24、32、40、48 h时检活，记录和计算存活率。

1.3.2正交试验

在单因素试验的基础上，进一步对保活温度()(17、20、23 ℃)、虾水比()(1∶8、1∶10、1∶12)和暂养时间()(12、24、36 h)进行3因素3水平的正交优化，以存活率≥50%时的存活时间、保活24 h时的存活率、保活24 h时的水中氨氮质量浓度和保活24 h时的水中菌落总数为检测指标，并进行验证试验。

1.4　罗氏沼虾低温保活试验及指标测定

以正交优化后的最优工艺条件进行罗氏沼虾的低温保活试验，并分别在保活0、12、24、36、48 h时取水样和虾样进行指标测定。

水质指标测定：使用5B-3N便携式氨氮测定仪测定水样的氨氮质量浓度；参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定养殖水样中的菌落总数；用JPB-607型便携式溶解氧分析仪测定水样的溶解氧质量浓度；用FE28型pH计测定水样pH。

虾体指标测定：采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定虾血液中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活力，肝脏中糖原质量分数、丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力，肌肉中糖原质量分数和乳酸浓度；用Waters2695高效液相色谱仪测定虾体ATP质量分数；用FE28型pH计测定虾肉pH。

1.5　数据处理

试验结果均用Microsoft Excel 2010和SPSS 24.0进行处理，在单因素方差分析(ANOVA)的基础上，采用Duncan法多重比较。运用Origin9.1绘图。

2　结果与分析

2.1　罗氏沼虾的临界温度

当温度缓慢降低至14～15 ℃时，虾体开始出现剧烈的应激反应，尾部抽搐、水中挣扎等；11～13 ℃时，虾体开始失去平衡，侧翻，对外界刺激反应非常强烈，步足仍能正常游动；10～11 ℃时，步足活动减缓且呼吸不规律，侧躺水中，反应迟钝，说明虾体已开始进入休眠状态；9 ℃时，虾体已完全静止，侧躺水底，对外界刺激已无反应，尾部蜷曲。若继续降温，则导致虾体死亡；若此时将虾体转移到常温水中，虾体在5～10 min内可以恢复至正常状态；因此，将9 ℃作为罗氏沼虾的临界温度。

2.2　罗氏沼虾低温保活工艺优化试验结果

2.2.1单因素试验结果

由图1可以看出，罗氏沼虾在温度12 ℃条件下的保活时间低于10 h；在15～20 ℃，随温度的增加，罗氏沼虾保活时间与对应的存活率均呈上升趋势；保活温度继续升高，保活时间与对应的存活率则均呈下降趋势；其中，20 ℃时，保活时间可达48 h以上，存活率超过60%；因此，选择保活温度20 ℃进行虾水比和暂养时间单因素试验。

图1　不同保活温度下的罗氏沼虾存活率

由图2可以看出，保活48 h内，罗氏沼虾的存活率随虾水比的减小而增大。当虾水比为1∶6时，保活时间只能达到24 h；当虾水比为1∶8时，存活时间可达32 h以上；而虾水比为1∶10、1∶12、1∶15时，保活48 h的存活率均在60%以上。在正常长距离实际保活运输过程中，运输成本和存活率都是要考虑的因素，因此，选择虾水比为1∶10进行暂养时间单因素试验。

图2　不同虾与水质量比的罗氏沼虾存活率

由图3可以看出，暂养时间在0～24 h时，罗氏沼虾保活48 h内的存活率随暂养时间的延长而增大；而暂养时间超过24 h时，存活率随暂养时间的延长而降低，暂养24 h保活效果最好。超过24 h，由于不投喂饵料，造成虾体体质逐渐下降而影响到保活时间和成活率。

图3　不同暂养时间的罗氏沼虾存活率

2.2.2正交试验结果

正交试验结果列于表1。存活时间、存活率越大，虾的保活效果越好；水体氨氮质量浓度、菌落总数越小，虾的保活效果越好。保活温度、虾水比、暂养时间对不同参考指标的影响依次减小，最佳水平为232，即保活温度20 ℃、虾水比1∶12、暂养时间24 h。验证试验显示，在此条件下罗氏沼虾保活24 h内的存活率为100%，保活48 h时存活率达80%以上，而25 ℃条件下保活24 h存活率低于50%；因此，确定232为罗氏沼虾低温有水保活的相对最优工艺。

表1　罗氏沼虾低温保活正交试验结果

括号内数字为正交试验因素水平编号。

2.3　罗氏沼虾低温保活过程中水质指标和虾体指标的变化

2.3.1水质指标的变化

由表2可知，在罗氏沼虾低温保活过程中，除保活时间36、48 h的水样中溶解氧质量浓度外，水样中溶解氧质量浓度、氨氮质量浓度、pH及菌落总数均具有显著性变化(＜0.05)。随着保活时间的延长，氨氮质量浓度和菌落总数快速上升，引起水质pH的升高和溶解氧被大量消耗，因保活期间持续向保活箱中充氧及对保活温度的控制，溶解氧质量浓度和pH均在罗氏沼虾适宜生存的水体参数范围(溶解氧质量浓度≥4.0 mg/L，pH值7.0～8.5[6])内。

表2　罗氏沼虾低温保活过程中水体的溶解氧和氨氮质量浓度与pH及菌落总数

同列不同字母示不同保活时间处理间差异显著(<0.05)。

2.3.2虾体肌肉和血液与肝脏指标的变化

由表3可知，在低温保活过程中，除0、12、24 h的ATP质量分数外，肌肉糖原质量分数、乳酸浓度、pH和ATP质量分数均呈显著性变化(＜0.05)。在保活初期，罗氏沼虾为抵御低温环境而大量消耗肌肉糖原，导致肌肉糖原质量分数剧烈下降；在保活期间无能量补充，加之罗氏沼虾对水温环境的逐渐适应，使得ATP质量分数先保持平衡，后随着保活时间延长而快速下降；而虾体肌肉乳酸浓度不断累积，导致肌肉pH的持续下降。

表3　罗氏沼虾低温保活过程中的肌肉和血液及肝脏指标

同列不同字母示不同保活时间处理间差异显著(<0.05)。

罗氏沼虾低温保活过程中，虾体ALT和AST活性呈显著上升(＜0.05)趋势，说明在低温环境中虾体肝脏受到一定程度的损伤。随保活时间的延长，罗氏沼虾肝脏糖原质量分数呈显著下降(＜0.05)趋势，T-SOD活性呈先降后升趋势，而MDA含量呈先上升后下降趋势。

3　结论与讨论

本研究中，通过对保活温度、虾水比和暂养时间这3个因素进行罗氏沼虾低温保活工艺优化，得到最优工艺条件为保活温度20 ℃、虾水比1∶12、暂养时间24 h。对于属热带虾类的罗氏沼虾而言，20 ℃是其正常生存的较低温度，适当的低温环境可减少虾体的耗氧量，降低其新陈代谢，减轻水质恶化，提高存活率并延长存活时间。据此，设置保活温度为17～23 ℃的优化试验。这个温度与COYLE等[4]对罗氏沼虾适宜温度的研究结果相似。虾水比对于有水保活而言是关键因素之一，水量较多，在一定程度上降低水中氨氮质量浓度，减缓虾体应激反应，防止虾体因代谢紊乱而死亡，从而得到较好的保活效果。本研究通过单因素试验发现虾水比不大于1∶10时可明显提高罗氏沼虾的存活率和保活时间，通过正交优化后确定虾水比为1∶12。暂养是保活前的必要环节，适当的暂养可使虾体充分排泄，起到平衡虾体生理状态的关键作用。本研究中，确定暂养时间为24 h，若延长暂养时间，则会导致虾体活力下降，健康受损，对后续保活具有较大影响。

在低温保活过程中，水体中的菌落总数和氨氮质量浓度是影响虾体存活率的重要因素。水中氨氮急剧积累，细菌滋生，水中氧分压降低等因素会导致存活率下降[7]。本研究采用正交优化后的最佳工艺进行保活试验，其间水体菌落总数与氨氮质量浓度显著上升，这与丁亚涛等[8]对鳊鱼麻醉保活研究的结果相同。这可能是由于来自虾体本身排泄物的积累和部分虾体的死亡[9]导致微生物的生长繁殖。低温可防止嗜温、嗜热微生物滋生并抑制细菌的增长速率，降低虾体新陈代谢过程中氨氮的形成，有效延迟其毒性反应的发生。

本研究中，虾体肌肉pH和糖原、ATP质量分数下降，乳酸浓度显著上升(＜0.05)。在低温保活过程中，虾体肌肉中的糖原酵解生成乳酸[10-12]，乳酸的持续积累导致pH下降。ATP含量在保活24 h内的变化不明显，推测可能一方面在保活初期，水质环境好，尤其是溶解氧充足，为维持机体的稳态平衡，虾体能量主要由虾体内糖原的有氧氧化所供给；另一方面此时的ATP消耗速率不大于糖酵解重新合成ATP的速率[13]。而肌肉糖原的持续下降，主要是低温下虾体依靠持续消耗糖原来提供热量，抵御环境胁迫。

本低温保活试验中，虾体血液ALT和AST活力显著上升(＜0.05)，肝脏糖原质量分数显著下降(＜0.05)，T-SOD活力先降后升，而MDA含量则先升后降。长时间的低温保活会在一定程度上损伤虾体肝脏细胞，但虾体自身的抗氧化防御系统可大量清除保活过程中所产生的自由基，对虾体的存活起重要作用。随着保活时间的延长，水质的逐渐恶化，导致虾体有氧代谢强度降低，进而促使虾体内某些纤维蛋白发生变性，最终导致肝脏细胞受损[14]。ALT和AST是肝脏中重要的转氨酶，肝脏若受损，细胞膜通透性会增加[15]，使得原本存在肝脏细胞中的ALT、AST被释放到虾体血液中，从而导致血液中ALT和AST活性上升[16-17]。这可能也与皮质醇激素参与肝脏代谢的调节有关。此结果与周萌等[18]对南美白对虾急性降温研究的结果相同。T-SOD和MDA主要反映肝脏氧化应激水平，在低温保活过程呈负相关变化，说明在保活前期，虾体受到环境胁迫后产生大量自由基，此时活性氧产生的速率超过抗氧化防御系统的清除能力，虾体氧化应激反应升高，导致虾体组织生物细胞膜脂质过氧化，生成脂质过氧化产物，进而导致肝脏组织受损；而后虾体T-SOD活性逐渐上升，抗氧化能力恢复，虾体产生的自由基被清除，MDA含量下降，从而导致肝实质细胞凋亡数量下降[19]。董学兴等[20]通过对SOD和MDA的研究表明，氨氮胁迫是造成罗氏沼虾肌肉氧化损伤的主要因素，本研究的结论与其相似。T-SOD活性的上升对罗氏沼虾在低温条件下的存活起到重要作用。朱孟凯等[13]研究温度胁迫对凡纳滨对虾肝脏SOD活力的影响，其结果也证实了这一观点。

总的来说，低温有水保活法能在一定程度上有效控制水质恶化，降低罗氏沼虾在保活过程中的生理代谢，从而提高罗氏沼虾的存活率和存活时间。

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Test on keepingalive under water at low temperature

YANG Feng1, WU Han1, WANG Yixin1, LI Nian1, SHI Wenzheng1,2, WANG Zhihe1,2,3*

(1.Food College, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2.National Research and Development Center for Processing Technology of Freshwater Aquatic Products(Shanghai), Shanghai 201306, China; 3.Shanghai Aquatic Product Processing and Storage Engineering Technology Research Center, Shanghai 201306, China)

Through the single factor test and orthogonal test on the three factors of keeping alive temperature(12, 15, 17, 20, 23, 25 ℃), shrimp to water mass ratio(1∶6, 1∶8, 1∶10, 1∶12, 1∶15) and holding time(0, 12, 24, 36, 48 h), find the optimal conditions for the low temperature keeping alive of, and detect changes in the water quality indicators and shrimp tissue indicators including muscle, blood, liver, etc, to explore the mechanism of affecting the survival of. The results showed that the critical temperature ofwas 9 ℃; in the single factor experiment, the best keeping alive temperature was 20 ℃, the best shrimp to water mass ratio was 1∶10, and the best holding time was 24 h; in the orthogonal test, the optimal process was keeping alive temperature of 20 ℃, shrimp to water mass ratio 1∶12, holding time 24 h, and the survival rate within 24 h of keeping alive could reach 100%. The optimal process conditions after orthogonal optimization were used for keeping alive test in the low-temperature of, the concentration of ammonia nitrogen and the total number of colonies in the water samples increased significantly(＜0.05), but the dissolved oxygen mass concentration and pH were still changing within the suitable range. The mass fraction of muscle glycogen, pH and ATP mass fraction decreased, lactic acid concentration increased significantly(＜0.05), blood ALT and AST activities increased significantly(＜0.05), liver glycogen mass fraction decreased significantly(＜0.05), T-SOD activity first decreased and then increased, while the content of MDA first increased and then decreased. It shows that changes in water quality indicators would affect the normal physiological metabolism of shrimp muscles, blood and liver tissues, thereby affecting their survival time and survival rate.

; keep alive with water; keep alive at low temperature; keep alive temperature; holding time; keep alive time; survival rate

S983.210.9

1007-1032(2020)05-0601-07

杨丰，吴涵，王逸鑫，李念，施文正，汪之和．罗氏沼虾低温有水保活试验[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2020，46(5)：601-607．

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http://xb.hunau.edu.cn