水稻OsFAH基因启动子的克隆及表达分析

2020-11-11胡超陈彦成任春梅张学文黄丽华

湖南农业大学学报（自然科学版） 2020年5期

胡超，陈彦成，任春梅，张学文，黄丽华*

水稻基因启动子的克隆及表达分析

胡超1，陈彦成2,3，任春梅1，张学文1，黄丽华1*

(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.农业部长江中下游籼稻遗传育种重点实验室，湖南长沙 410125；3.湖南省水稻研究所，湖南长沙 410125)

以湘晚籼13号为材料，克隆了水稻基因启动子，构建了启动子与GUS基因融合表达载体，并转化拟南芥。序列分析结果表明，该启动子包含了启动子核心序列TATA-box和CAAT-box以及光响应元件等。GUS染色结果表明：在拟南芥幼嫩的子叶、下胚轴和真叶中，GUS的表达较强；随着叶片的衰老，GUS表达减弱；在根中，GUS主要在主根的维管柱内表达；黑暗处理会使GUS表达减弱；在黑暗条件下，基因表达下调。

水稻；拟南芥；延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)；酪氨酸降解途径；启动子；基因；GUS表达

在动物中，酪氨酸在酪氨酸氨基转移酶和对羟基苯丙酮酸双氧化酶作用下转化成尿黑酸；尿黑酸经尿黑酸1,2双加氧酶、马来酰乙酰乙酸异构酶和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)催化，降解为乙酰乙酸和延胡索酸[1]。该降解途径在动物生长发育中发挥着重要作用。FAH是酪氨酸降解途径中的关键酶。FAH活性丧失会使细胞积累酪氨酸降解代谢中间产物，促发动物I型酪氨酸血症[2-4]。在植物中，酪氨酸在酪氨酸氨基转移酶和对羟基苯丙酮酸双氧化酶作用下也转化成尿黑酸[5]。植物zeta类谷胱甘肽转移酶具有和动物马来酰乙酰乙酸异构酶类似的结构和功能[6-7]。拟南芥尿黑酸1,2双加氧酶、马来酰乙酰乙酸异构酶和FAH编码基因呈现组成型表达,并且它们的体外表达产物可以将尿黑酸降解为乙酰乙酸和延胡索酸[8-9]。拟南芥FAH功能丧失会使细胞积累酪氨酸降解代谢中间产物，使细胞在短日照下死亡[10-11]。这些结果表明，植物中也存在一条类似于动物的酪氨酸降解途径，并且该途径在拟南芥生长发育中也发挥着重要功能。然而，除拟南芥外，酪氨酸降解途径在其他植物中的功能尚不清楚。

本试验克隆了湘晚籼13号基因的启动子，并分析了启动子的表达特征及基因的表达，旨在为进一步研究酪氨酸降解途径在水稻生长发育中的作用提供依据。

1　材料和方法

1.1　材料

水稻(L.)品种湘晚籼13号，由农业部长江中下游籼稻遗传育种重点实验室提供。拟南芥()Columbia生态型由湖南农业大学细胞生物学实验室提供。

1.2　方法

1.2.1基因启动子的克隆及序列分析

根据籼稻FAH编码基因序列，采用Primer 5.0设计引物PROF1(5′-AACCTATTTTCGT TCAGCGCG-3′，下划线显示I位点)和PROR1 (5′-CATGTGCCGACTCCTCTCTCGT-3′，下划线显示I位点)。

水稻种子发芽生长2周后，采用CTAB法[12]提取叶片DNA。以提取的DNA为模板，PROF1和PROR1为引物，PCR扩增启动子序列。克隆片段与T载体连接重组后，转化大肠埃希菌DH5α，菌落PCR检测的阳性克隆由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。序列分析通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和PlantCare数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线进行。

1.2.2启动子与GUS基因融合表达载体的构建

启动子与GUS基因融合表达载体的构建如图1。克隆的启动子经I和I酶切后，与载体pCAMBIA1301连接重组；重组分子转化大肠埃希菌，酶切检测重组载体，并对重组载体进行测序验证。采用电击法将重组载体转化农杆菌GV3101。PCR检测含重组载体的农杆菌。

图1　OsFAH启动子与GUS基因融合表达载体

1.2.3拟南芥的转化

拟南芥种子用20%的次氯酸钠消毒液处理15 min，无菌水洗涤3次后接种于含1%蔗糖的MS培养基中。种子于4 ℃春化3 d后置于光照培养箱(22 ℃，16 h光照、8 h黑暗)中培养。将生长1周的幼苗移栽至营养土中生长至开花。参照蔡薇等[13]的方法转化拟南芥。

1.2.4转基因拟南芥的筛选和鉴定

转基因植株种子在添加25 mg/L潮霉素的MS培养基上发芽生长2周后，挑选生长正常的植株移栽至营养土中继续生长。采用CTAB法提取水稻幼嫩叶片的DNA[12]。以提取的DNA为模板，PROF2 (5′-GCTTCCGTTCATCTGCGCCTAT-3′)和GUS1 (5′-ACACAAACGGTGATACGTACAC-3′)为引物，PCR鉴定转基因植株。

1.2.5拟南芥的黑暗处理及GUS染色

将在MS培养基上生长1周或2周的拟南芥置于温度为22 ℃的人工气候箱中，黑暗处理6 h后进行GUS染色。

参照蔡薇等[13]的方法进行GUS染色。3次重复。

1.2.6基因表达分析

将生长2周的水稻幼苗置于黑暗中处理3、6、9 h后提取叶片的RNA。参照TAKARA公司的RNAiso Plus和PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行RNA提取和反转录。根据籼稻基因序列，采用Primer 5.0设计引物FP1 (5′-CGCCAGGAAACGCTCAAC-3′)和RP1(5′-GTC GCTCATGGGAACAAGG-3′)。以FP1和RP1为引物，18S rRNA为内参，参照ROCHE公司的FastStart Universal SYBR Green Master荧光定量PCR试剂盒说明书，于ABI 7300上进行荧光定量PCR反应。PCR反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，40个循环。3次重复。基因表达量按照2-ΔΔCt方法计算。18S rRNA荧光定量PCR反应引物为FP2(5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′)和RP2(5′-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3′)[14]。

2　结果与分析

2.1　水稻OsFAH基因启动子的克隆及序列分析

采用PCR法克隆了水稻基因启动子的序列。测序结果表明，该序列长度为2 000 bp，与Genbank中预测的序列一致(图2)。采用PlantCARE对启动子包含的元件进行分析，结果(图3、表1)表明，除了含有核心元件TATA-box和CAAT- box外，启动子还含有光响应元件(GT1-motif、Box 4、GATA-motif、MRE、G-box)、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif、生物钟控制元件Circadian及脱落酸响应元件ABRE。

M　DNA Marker 1 kb；1　OsFAH启动子。

图3　OsFAH启动子序列

表1　OsFAH启动子包含的作用元件

2.2　PCR鉴定转基因拟南芥

启动子与载体pCAMBIA1301重组后，转化至农杆菌中。培养含重组载体的农杆菌，采用浸花序的方法将重组载体转化拟南芥。将转基因植株种子接种至添加潮霉素的MS培养基上发芽生长，筛选对潮霉素具有抗性的转基因植株。以转基因植株叶片DNA为模板，启动子序列为上游引物，GUS基因序列为下游引物，PCR检测转基因植株，结果如图4所示。从部分转基因植株中扩增出目的条带，说明目的序列已经整合至拟南芥基因组中。

M　DNA Marker 2 kb；1　对照植株；2～11　转基因植株；12　质粒阳性对照。

2.3　转基因拟南芥中GUS的表达分析

取生长3、7、14 d的转基因拟南芥，观察GUS的表达。结果表明：在幼嫩的子叶和真叶中，GUS的表达量较高(图5-c、图5-d)，随着叶片的衰老，GUS的表达减弱(图5-e)；GUS在衰老子叶中的表达高于其在衰老真叶中的表达(图5-e)；在衰老的真叶中，GUS主要在叶尖、叶脉和叶柄处表达，在叶尖和叶柄处的表达量较高(图5-e)；在下胚轴中，GUS也有较高的表达量(图5-c)；在根中，GUS仅在根的维管柱内表达，在根毛和根尖中都未表达(图5-f、图5-g)；GUS在侧根中的表达低于其在主根中的表达(图5-h)。

a　非转基因对照植株；b　35S阳性对照植株；c　生长3 d的转基因拟南芥；d　生长7 d的转基因拟南芥；e　生长14 d的转基因拟南芥；f　根及根毛；g　主根根尖；h　侧根。

2.4　OsFAH启动子对黑暗处理的响应

为探究启动子对光的响应，将转基因拟南芥进行黑暗处理后检测GUS的表达。结果(图6)显示，黑暗处理1周和2周，植株真叶和子叶中的GUS表达均明显降低。

a　生长1周的对照植株；b　黑暗处理1周的植株；c　生长2周的对照植株；d　黑暗处理2周的植株。

2.5　黑暗处理对OsFAH基因表达的影响

为进一步探究表达对光的响应，对基因在黑暗条件下的表达进行了分析。结果(图7)显示，黑暗处理使表达下调；黑暗处理3 h，的相对表达量降低了约70%；黑暗处理6 h或9 h，其表达量降低了约80%。

图7　OsFAH基因在黑暗条件下的相对表达量

3　结论与讨论

启动子是位于基因上游一段调控基因表达的DNA序列[15-16]。通过对目的基因启动子序列特征和表达特征的研究，可以揭示目的基因的表达特征及其调控模式，从而预测该基因的功能。FAH是酪氨酸降解途径中的关键酶。为了探究酪氨酸降解途径在水稻生长发育中的作用，本研究中，从湘晚籼13号中克隆了基因的启动子，序列分析结果表明，该启动子含有TATA-box和CAAT-box，这2个元件是真核生物启动子的核心序列，决定着转录的起始和强度[17]；启动子能够驱动GUS基因在拟南芥中表达，说明该启动子不但具有真核生物启动子的基本特征，而且具有表达活性。启动子含有许多光响应元件，如G-box和GT1-motif等。G-box普遍存在于光调控基因的启动子中，一些转录因子(如HY5)与G-box结合，调控启动子对光的响应，进而影响基因的表达[18]。GT1-motif是基因响应光信号的必要元件[19]。在黑暗条件下，表达下调可能与启动子含有这些光响应元件相关。拟南芥酪氨酸氨基转移酶、尿黑酸1,2双加氧酶和马来酰乙酰乙酸异构酶基因的表达都受到光的调控[20]。在不同光周期下，拟南芥FAH基因表达不同；FAH突变体在长日照下生长正常，在短日照下会出现细胞死亡[21]。这些结果表明，酪氨酸降解途径可能参与了植物对光的响应。此外，启动子还包含了脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、生物钟控制元件以及厌氧响应元件，说明表达可能还受到脱落酸等因素的调控。

拟南芥FAH编码基因在不同组织中都有表达[9]。启动子能够驱动GUS在拟南芥的叶片、下胚轴及根中表达，说明水稻基因与拟南芥FAH编码基因一样，在不同组织中都有表达。然而，相对于衰老组织，GUS在幼嫩组织中的表达较强；相对于根，GUS在地上部分组织中的表达较强。这些结果表明，启动子在幼嫩组织和地上部分组织中具有较强的表达活性，暗示该基因可能在水稻幼嫩组织及地上部分组织的生长发育中发挥着更重要的功能。在根中，GUS表达仅限于在维管柱中，暗示可能参与了根中物质的运输过程。

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Cloning and expression analysis ofpromoter in rice

HU Chao1, CHEN Yancheng2,3, REN Chunmei1, ZHANG Xuewen1, HUANG Lihua1*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Key Laboratory of Indica Rice Genetics and Breeding in the Middle and Lower Reaches ofYangtze River Valley, Ministry of Agriculture, P.R. China, Changsha, Hunan 410125, China; 3.Hunan Rice Research Institute, Changsha, Hunan 410125, China)

The promoter ofgene was cloned fromcultivar ‘Xiangwanxian 13’, and analyzed for the presence of putative-elements. Thepromoter contained basal promoter elements, TATA-box, CAAT-box, and the-elements involved in light response. The promoter was cloned into a vector that contains the GUS gene, and introduced into. GUS expression in the transgenicwas detected by histochemical staining. Strong GUS expression was observed in young cotyledons, hypocotyls, and true leaves. However, low GUS expression was only detected in old leaves. GUS expression was found in the vascular tissues of the taproots. And, GUS expression driven bypromoter andexpression were decreased when plants were exposed to darkness.

;; fumarylacetoacetate hydrolase; tyrosine degradation pathway; promoter;gene; GUS expression

S511；Q786

1007-1032(2020)05-0527-06

胡超，陈彦成，任春梅，张学文，黄丽华．水稻基因启动子的克隆及表达分析[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2020，46(5)：527-532．

HU C, CHEN Y C, REN C M, ZHANG X W, HUANG L H. Cloning and expression analysis ofpromoter in rice[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(5): 527-532.

http://xb.hunau.edu.cn