茶树CCoAOMT原核表达及酶促条件优化

唐倩，陈丝，欧淑琼，李勤，李娟*，王坤波*

茶树原核表达及酶促条件优化

唐倩1,2,4，陈丝1,2,4，欧淑琼1,2,4，李勤1,2,3,4，李娟1,2,3,4*，王坤波1,2,3,4*

(1.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙 410128；4.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128)

优化了重组茶树咖啡酰辅酶A--甲基转移酶基因()在大肠杆菌中的表达，采用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为底物，进行体外酶促反应，采用HPLC测定反应产物EGCG3"Me的生成量。结果表明，在BL21中能够高效表达，最优条件为诱导温度37 ℃，诱导时间4 h，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mmol/L；重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱梯度洗脱达到了较好的纯化效果；重组酶在体外能够催化EGCG，合成EGCG3"Me，底物EGCG最佳浓度为0.05 mmol/L，最适温度为37 ℃，最适pH值为4。

茶树；咖啡酰辅酶A--甲基转移酶；原核表达；纯化；酶促合成

咖啡酰辅酶A--甲基转移酶(CCoAOMT)是一类S-腺苷-L-甲硫氨酸( SAM )甲基转移酶，它能催化类黄酮、生物碱等化合物，生成甲基化酚类代谢物[1-2]。茶叶中甲基化表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，主要是(－)-表没食子儿茶素3-(3--甲基)没食子酸酯(EGCG3"Me)，只有少数茶树种质资源的EGCG3"Me含量在1%以上[3-5]。SAIJO[6]首次从绿茶中分离出EGCG3"Me；后续的研究表明其抗过敏、抗炎效果强于EGCG[7-11]。与化学合成方法相比，运用酶工程技术合成EGCG3"Me，反应条件相对温和、安全，过程简单，后期产物的纯化也较为简易。ZHANG等[12]通过克隆茶树咖啡酰辅酶A--甲基转移酶基因()，在大肠杆菌中进行诱导表达，获得了相对分子质量约28 000的重组蛋白；进一步研究蛋白的催化活性，重组茶树CCoAOMT能够催化EGCG生成甲基化EGCG，且EGCG3"Me生成量相对较高。

笔者以报道的茶树CCoAOMT基因序列为根据，构建了重组融合表达载体pET-28a-，优化其原核表达条件，并利用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化，获得具有催化活性的重组蛋白，优化重组酶CCoAOMT体外催化EGCG合成EGCG3"Me的反应条件，以期为生物合成EGCG3"Me提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

‘金牡丹’茶树一芽二叶(夏季)，采自湖南省茶叶研究所；大肠杆菌BL21(DE3)为北京全式金生物技术有限公司产品；EGCG和EGCG3"Me标准品为Sigma产品；SAM为上海生物工程有限公司产品。

1.2　方法

1.2.1重组表达载体的构建

提取茶树鲜叶总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录，获得茶树cDNA。根据NCBI提供的序列号JQ 790528.1设计引物，上游引物为5′-CGCGGATCCATGGCAACAAACGGAGA A-3′，下游引物为5′-GGCTCGAGTCAGCAGACG CCGGGC-3′，酶切位点为HI、I，进行PCR扩增，切胶回收PCR产物。利用平末端T载体连接CCoAOMT基因并转化至Transl-T1感受态细胞中，提取阳性克隆菌Transl-T1质粒并测序。重组质粒-T及pET-28a载体经双酶切后进行回收纯化。T4DNA连接酶连接质粒与载体双酶切产物并转化至DH 5α，提取阳性菌落质粒，最终获得表达载体pET-28a-。

1.2.2原核表达条件的优化及蛋白纯化

重组质粒pET-28a-转化至BL21 (DE3)，经含卡那霉素的LB固体培养基扩大培养后，挑选阳性单菌落，在3 mL液体培养基(Kan+)试管中过夜培养。取3 µL培养液在3 mL LB液体培养基(100 mg/L Kan+)中培养3 h后冰上放置2 min，分别加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L，37 ℃、180 r/min诱导4 h后离心，收集菌体。菌体冰上放置，待菌体重悬后超声破碎，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，破壁蛋白沉淀部分同样进行重悬。沉淀液与上清液于100 ℃水浴10 min，使蛋白变性，水浴结束，沉淀液12 000 r/min室温离心15 min后，取上清。SDS-PAGE电泳(12%分离胶、5%浓缩胶)检测上清液及沉淀液上清。继而对诱导表达的蛋白进行纯化。

将Ni-NTA树脂重悬放置于层析柱，加入洗脱液冲洗多次。上清液经0.45 µm滤膜过滤后，加入Ni-NTA树脂。上样完成后用蛋白洗脱液进行梯度洗脱，封闭层析柱下端静置。收集分次洗脱样进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.3酶促反应条件优化

15 mL反应体系中(含1.2 mmol/L SAM、0.2 mmol/L MgCl2)加入1 mL由重组质粒pET-28a-转化至BL21诱导表达后保留的菌种经超声破碎的上清液，EGCG浓度设置为0.01、0.03、0.05、0.07、0.10、0.15 mmol/L，37 ℃水浴恒温1.5 h，加入200 µL 1 mol/L HCl终止反应，并用20 mL乙酸乙酯萃取，离心、旋转浓缩干燥萃取液，用0.2 mL甲醇溶解后过膜，按文献[13]方法对产物EGCG3"Me的生成量进行HPLC分析。选用最佳EGCG浓度，调节反应温度为25、35、37、40、45 ℃，选用最佳EGCG浓度和温度，使用柠檬酸-磷酸盐调节反应体系pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，进行反应和HPLC分析。

2　结果与分析

2.1　pET-28a-CCoAOMT重组质粒的鉴定

CCoAOMT基因经PCR扩增后，获得了900 bp左右的特异性条带。转化至Transl-T1，提取质粒并测序，双酶切重组正确质粒和pET-28a载体，再把酶切产物连接后转化至DH 5α进行菌落PCR扩增，经测序验证序列，结果(图1)表明，成功构建了pET-28a-重组质粒。

1～3　随机挑选的单菌落；4　DNA标准条带。

2.2　重组茶树pET-28a-CCoAOMT的诱导表达

对诱导温度和诱导时间进行优化，发现在37 ℃下诱导4 h，蛋白表达效果最佳，进而用于筛选IPTG浓度。不同的IPTG终浓度诱导下，在BL21中均得到表达(图2)。上清液及沉淀蛋白中都存在特异性条带，所得的重组蛋白相对分子质量约为28 000，与理论值相符。上清液和沉淀中均存在重组蛋白，表明重组蛋白CCoAOMT是以包涵体形式存在的。比较发现，重组蛋白在上清液和沉淀中表达差异明显，上清液中的表达量相对较高。IPTG终浓度为0.5 mmol/L时，上清和沉淀部分的蛋白表达量均较高，而后提高诱导剂浓度，差异并不明显。可见，重组质粒最佳诱导表达条件为：诱导温度37 ℃，诱导时间4 h，IPTG终浓度0.5 mmol/L。

A　上清液部分；B　沉淀部分；M　蛋白标准条带；1~5　IPTG终浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L。

2.3　重组蛋白CCoAOMT的纯化

表达菌株BL21扩大诱导后，利用Ni-NTA亲和色谱柱纯化蛋白。图3为重组蛋白分次洗脱的SDS-PAGE电泳图谱。泳道5为经梯度洗脱纯化后的蛋白，其蛋白相对分子质量约为28 000，与理论值相符。Ni-NTA树脂基本能吸附重组蛋白。2次洗脱后，大肠杆菌内及反应中的杂蛋白基本洗脱，第3次洗脱少量蛋白被洗脱出来，说明重组蛋白易洗脱。目的蛋白经Elute Buffer第4次洗脱时基本洗脱，而Wash Buffer洗脱液仅洗脱出少量的目的蛋白。

M　蛋白标准条带；1　上清液；2　第1次洗脱液；3　第2次洗脱液；4　第3次洗脱液；5　第4次洗脱液。

2.4　酶促产物的HPLC分析

图4为反应产物的HPLC图谱。在EGCG3"Me对照品相应保留时间25 min左右处可见1个色谱峰，经HPLC分析，鉴定为EGCG3"Me，表明重组蛋白CCoAOMT具有生物学活性，能催化EGCG生成EGCG3"Me。

图4　EGCG酶促反应产物的HPLC图谱

2.5　不同酶促反应条件下的产物生成量

从表1可以看出，当EGCG浓度为0.05 mmol/L时，转化率达11.1%；继续提高EGCG浓度，EGCG转化率反而降低。不同酶促温度下，EGCG3"Me生成量35 ℃至37 ℃增幅较大，37 ℃时EGCG3"Me生成量最大；而后再提高温度，EGCG3"Me生成量降低。酶促反应体系pH值从3.0增加到4.0时，EGCG3"Me生成量增加并出现最高值；而后继续升高pH值，EGCG3"Me生成量下降；pH为4.0时，酶促活性最佳，EGCG3"Me生成量最高。由此可见，该酶促反应最佳的底物浓度为0.05 mmol/L，温度为37 ℃，酶促pH值为4.0。

表1　不同酶促反应条件下的EGCG转化率和EGCG3"Me生成量

3　结论与讨论

对重组在大肠杆菌中诱导表达条件进行优化，最佳诱导表达条件为37 ℃下诱导4 h ，IPTG终浓度为0.5 mmol/L。利用Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱达到了较好的纯化效果。用重组CCoAOMT，以EGCG为底物进行酶促反应，重组酶能催化EGCG生成EGCG3"Me，且最佳的EGCG底物浓度为0.05 mmol/L，酶促温度为37 ℃，酶促pH值为4.0。

大肠杆菌诱导表达体系中，诱导温度和时间、IPTG浓度均能影响目的蛋白的表达[14-16]。本研究在成功构建重组融合表达载体pET-28a-的基础上，使用优化后的诱导温度(37 ℃)和诱导时间(4 h)，改变IPTG终浓度，分析了重组茶树诱导表达的最佳IPTG终浓度。结果表明，同一IPTG终浓度条件下，目的蛋白在上清液中表达量均较沉淀部分高，差异明显；不同IPTG终浓度条件下，上清液中的蛋白表达量在0.5～1.0 mmol/L，表达稳定，继续增大IPTG浓度，对蛋白的表达量影响不明显。考虑到IPTG诱导剂具有潜在毒性，最终确定其最低有效诱导终浓度为0.5 mmol/L，即在大肠杆菌中的最佳表达条件为37 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h。

重组蛋白CCoAOMT经Ni-NTA亲和层析柱梯度洗脱，达到了较好的纯化效果，呈现出单一的目的蛋白条带，纯化后的蛋白相对分子质量约为28 000。使用梯度咪唑洗脱，可以控制Ni柱中结合位点的数量，从而对目标蛋白的结合效率进行调整，以达到纯化重组蛋白的目的[17]。洗脱液中咪唑浓度较高，有助于目的蛋白的洗脱。对重组蛋白的活性进行验证，以主要的酶促产物EGCG3"Me生成量为指标，进一步探究其体外酶促反应条件，结果显示，重组蛋白CCoAOMT能催化EGCG生成EGCG3"Me，重组酶具有催化活性，酶促反应的最佳EGCG底物浓度为0.05 mmol/L，酶促温度为37 ℃，酶促pH值为4.0。

[1] YE Z H．Association of caffeoyl coenzyme A 3--methy- ltransferase expression with lignifying tissues in several dicot plants[J]．Plant Physiology，1997，115(4)：1341- 1350．

[2] 王华美，于延冲，付春祥，等．木质素合成关键酶咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的研究进展[J]．基因组学与应用生物学，2014，33(2)：458-466． WANG H M，YU Y C，FU C X，et al．Progress of a key enzyme-caffeoyl-CoA 3--methyltransferase in lignin biosynthesis[J]．Genomics and Applied Biology，2014，33(2)：458-466．

[3] 费冬梅，林智，吕海鹏，等．EGCG--甲基转移酶(EOMT)在重组大肠杆菌中的表达条件研究[J]．茶叶科学，2011，31(4)：333-340． FEI D M，LIN Z，LYU H P，et al．Study on expression conditions of EGCG--methyl transferase in recombinantbacteria[J]．Journal of Tea Science，2011，31(4)：333-340．

[4] 任晓萌，商虎，高晨曦，等．茶叶中天然累积和人工合成的甲基化EGCG的研究进展[J]．食品研究与开发，2019，40(4)：202-208． REN X M，SHANG H，GAO C X，et al．Research progress of natural accumulation and synthetic-methylated EGCG in tea plants[J]．Food Research and Development，2019，40(4)：202-208．

[5] 吕海鹏，谭俊峰，林智．茶树种质资源EGCG3"Me含量及其变化规律研究[J]．茶叶科学，2006，26(4)：310-314． LYU H P，TAN J F，LI Z．Study on the content of EGCG3"Me in different tea germplasms and its changes[J]. Journal of Tea Science，2006，26(4)：310-314．

[6] SAIJO R．Isolation and chemical structures of two new catechins from fresh tea leaf[J]．Agricultural and Biological Chemistry，1982，46(7)：1969-1970．

[7] SANO M，SUZUKI M，MIYASE T，et al．Novel antiallergic catechin derivatives isolated from oolong tea[J]．Journal of Agriculture and Food Chemistry，1999，47(5)：1906-1910．

[8] MAEDA-YAMAMOTO M，SANO M，MATSUDA N，et al．The change of epigallocatechin-3--(3--methyl) gallate content in tea of different varieties，tea seasons of crop and processing method[J]．Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi，2001，48(1)：64-68．

[9] SUZUKI M，SANO M，YOSHIDA R，et al. Epimerization of tea catechins and-methylated derivatives relationship between epimerization and chemical structure[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(2)：510-514．

[10] MAEDA-YAMAMOTO M，TACHIBANA H．Anti- allergic action of-methylated EGCG in green tea cultivar Benifuuki[J]．Journal of Food and Drug Analysis, 2012，20(1)：313-317．

[11] TANTOUSH Z，APOSTOLOVIC D，KRAVIC B，et al. Green tea catechins of food supplements facilitate pepsin digestion of major food allergens，but hampers their digestion if oxidized by phenol oxidase[J]．Journal of Functional Foods，2012，4(3)：650-660．

[12] ZHANG Y，LYU H P，MA C Y，et al．Cloning of a caffeoyl-coenzyme A-methyltransferase fromand analysis of its catalytic activity[J]．Journal of Zhejiang University-SCIENCE B，2015，16(2)：103-112．

[13] 李银花，李娟，龚雪，等．高效液相色谱法同时测定茶叶中8种儿茶素、3种嘌呤碱和没食子酸[J]．食品科学，2011，32(18)：214-217． LI Y H，LI J，GONG X，et al．Simultaneous determination of eight catechins，three purine alkaloids and gallic acid in tea by high-performance liquid chromatography[J]. Food Science，2011，32(18)：214-217．

[14] GAO Q，ZHAO J M，SONG L S，et al．Molecular cloning，characterization and expression of heat shock protein 90 gene in the haemocytes of bay scallop[J]. Fish＆Shellfish Immunology，2008，24(4)：379-385．

[15] 杨隆兵，国果，马慧玲，等．家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测[J]．中国生物工程杂志，2019，39(4)：24-31． YANG L B，GUO G，MA H L，et al．Optimization of prokaryotic expression conditions and antifungal activity detection of antibacterial peptide AMPs17 protein in[J]．China Biotechnology，2019，39(4)：24-31．

[16] 魏婕，易忠，魏玉荣，等．IPTG诱导浓度、时间对Asia I型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响[J]．中国畜牧兽医，2009，36(5)：63-66． WEI J，YI Z，WEI Y R，et al．Effect of induced concentration and time of IPTG on the expression of VP1 protein of FMDV type Asia I[J]．China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2009，36(5)：63-66．

[17] 田阳，饶欢，薛文通．花生致敏原Ara h 1的重组表达与纯化[J]．中国食品学报，2020，20(8)：20-28． TIAN Y，RAO H，XUE W T．Expression and purification of recombinant peanut allergen Ara h 1[J]．Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2020，20(8)：20-28．

Prokaryotic expression offromand optimization of enzymatic conditions

TANG Qian1,2,4, CHEN Si1,2,4, OU Shuqiong1,2,4, LI Qin1,2,3,4, LI Juan1,2,3,4*, WANG Kunbo1,2,3,4*

(1.National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Key Laboratory of Education Ministry for Tea Science, Changsha, Hunan 410128, China; 3.Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha, Hunan 410128, China; 4.Horticulture College, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

The expression of the recombinant caffeinyl-coenzyme A-methyltransferase gene() incells was optimized and the enzyme was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The enzymatic reaction was carried out in vitro with epigallocatechin gallate (EGCG) as substrate, and EGCG3"Me, the reaction products, were analyzed by HPLC. As a result,was highly expressed inBL21 andthe best induction conditions of recombinantwas 0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The recombinant CCoAOMT could catalyze EGCG to EGCG3"Me in vitro and the optimal reaction conditions include substrate EGCG of 0.05 mmol/L, pH of 4 andtemperature of 37 ℃.

; caffeinyl-coenzyme A-methyltransferase; prokaryotic expression; purification; enzymatic synthesis

S571.101

A

1007-1032(2020)05-0533-05

唐倩，陈丝，欧淑琼，李勤，李娟，王坤波．茶树原核表达及酶促条件优化[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2020，46(5)：533-537．

TANG Q, CHEN S, OU S Q, LI Q, LI J, WANG K B. Prokaryotic expression offromand optimization of enzymatic conditions[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(5): 533-537.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-22

2020-08-01

国家科学技术部重点研发计划课题(2018YFC1604403)；湖南省科学技术厅中央引导地方科技发展项目(2019XF5041)；湖南省科学技术厅重点研发计划项目(2018NK2031)

唐倩(1996—)，女，湖南郴州人，硕士研究生，主要从事茶树分子生物学研究，250482928@qq.com；*通信作者，李娟，博士，讲师，主要从事茶树资源及分子生物学研究，xixi_lj@126.com；*通信作者，王坤波，博士，教授，主要从事茶树分子生物学和次生代谢研究，wkboo163@163.com

责任编辑：罗慧敏

英文编辑：罗维