大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立的改良方法

王平安,杨珂伟,王 静,焦 成

(武汉华联科生物技术有限公司,武汉 430206)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)严重危害着全球人类的健康,成为主要死亡原因之一[1]。 目前,人们公认的对AMI 最有效的治疗方法是冠状动脉再灌注,但也伴随着再灌注损伤的问题[2]。 对于心肌缺血再灌注损伤的研究成为了全球的热点问题之一。 大鼠心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)造模后大鼠的成活率及造模成功率是制约模拟临床心血管、药理药效等方面研究的关键因素之一,但构建一套标准的、可持续操作的心肌缺血模型的制约因素却有很多[3-4]。 快速操作法和常规开胸法是MIRI 造模的两种常用方法,但存在开胸时间短对实验操作技术要求高、术中出血、气胸等因素导致模型成功率低下,因此,本研究对MIRI 造模进行改良优化,并与这两种常用的方法进行比较,从模型构建成功率、大鼠存活率和心肌缺血损伤等方面探讨改良式造模操作的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠45 只,8 周龄,体重280 ～300 g,由华中农业大学动物实验中心提供[SCXK(鄂) 2015-0018]。 本次研究实验动物的饲养、建模等均在SPF 级屏障环境动物房实验操作间进行[SYXK (鄂) 2018-0104],实验动物的使用遵循了3R 原则。 所有实验操作均获得武汉华联科生物技术有限公司实验动物福利伦理委员会的审批(批准号:HLK-20190218-01)。

1.2 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠购自美国Sigma 公司;TTC 染色剂、伊文思蓝染液均购自武汉华联科生物技术有限公司。 呼吸机购自北京北瑞未来分析仪器有限公司;体视显微镜购自舜宇光学科技;心电图机购自广州市三锐电子科技有限公司;数码相机购自日本Nikon 公司;小动物撑开器购自海德创业(北京)生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及模型构建

45 只SD 大鼠随机分为3 组:快速操作组、常规开胸组、改良组,每组15 只。 大鼠适应性饲养1 周,自由进食,昼夜均衡,温度23℃～26℃,湿度(50±5)%,术前12 h 禁食不禁水。

快速操作组:依据文献报道[5],采用不使用呼吸机快速造模方式进行造模。 3%的戊巴比妥钠腹腔注射剂量1.5 mL/kg 腹腔注射[6],止血钳快速分开3～4 肋间,挤出心脏快速结扎送回胸腔。 用止血钳把皮肤夹住闭胸后观察心电图变化,成功标准T波高耸或倒置,缺血30 min 后松开止血钳,抽出扎线再灌注。 快速缝合胸腔及皮肤。

常规开胸组:依据文献报道[7],采用开胸造模方式进行造模。 大鼠麻醉后接呼吸机,常规开口剪断2 根肋骨,打开胸腔充分暴露心脏后行结扎,在左心耳下方3～4 mm 处左冠状动脉与后降支分叉处用现代标准代码5-0 无创伤丝线穿过左冠脉降支,进针深度0.2～0.4 mm,结扎后30 min 后再灌注,闭胸缝合。

改良组:3%的戊巴比妥钠腹腔注射剂量1.5 mL/kg 腹腔注射,颈部及胸腔毛发剪除消毒,颈部中间开口1 cm,胸骨舌骨肌止血钳钝性分离暴露气管,显微剪刀切开小口,开口不宜过大,插入呼吸机插管,呼吸机参数:(呼吸频率:90 次/min;呼吸比:1∶2;朝气量:11 cc)生理盐水棉球盖住创口。 于第3、4 肋骨间(可手按胸腔感知心脏跳动最明显位置)皮肤开口1 cm,下行处有一条小静脉可两端止血钳夹住10 s,剪刀剪断,肋间开小口0.5 cm(图1a)。 2 个撑开器上下左右以肋骨配合撑开,可见心脏,止血钳挑开心包膜,再夹住胸腺部位固定,另一只手持针(5-0 缝合线,3×8 圆针)左心耳下方3 mm 处进针(图1b)。 深度1 mm,宽度2 mm(图1c)扎针进线后在上方放一根线径0.53 mm,长5 cm 鱼线,活结结扎(图1 d 和图1e)。 缝合闭胸,30 min 后轻抽鱼线再灌注(图1f)。 以上3 组术后给予80 万青霉素0.5 mL/只抗炎。 分别于实验后24 h 和1 周取材心脏。

1.3.2 观测指标

通过测量Ⅱ导联心电图同步监测大鼠结扎30 min 后的心电图表现,并与术前标准的Ⅱ导联心电图比较,观察大鼠心电图有无再灌注心律失常现象。

1.3.3 心脏TTC+伊文思蓝染色

缺血再灌注24 h 和1 周结束后,右侧颈内静脉内注入1%伊文思蓝1 mL。 待鼠口唇蓝染后,取下心脏,剔除心房心耳,-20℃速冻约20 min,便于切片。 平行房室沟将左室切成1.5 ～2 mm 厚的切片。切片入TTC 染液(2%)避光浸染,30℃避光孵育15～30 min,边孵育边观察样本颜色变化。 切片入10%中性福尔马林中固定24 h。 吸干组织表面液体,并将组织表面多余的染色液冲洗掉,此时可肉眼观察并立即拍照。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0 进行统计学分析,计量资料采以平均数±标准差( ¯x ±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

图1 大鼠MIRI 造模改良方法Figure 1 An improved method for establishing a rat model of MIRI

图2 结扎前后大鼠心电图变化Figure 2 Changes of electrocardiogram in rats before and after ligation

2 结果

2.1 造模成功心电图表现

大鼠结扎后心电图ST 段出现抬高,表现出心律失常现象,提示心肌缺血再灌注大鼠模型构建成功,见图2。

2.2 模型存活率和成功率比较

记录三组大鼠的存活和造模成功情况,比较各组间的存活率和造模成功率:快速操作组7 只大鼠死亡,存活率为53.33%,3 只造模失败,造模成功率为33.33%;常规开胸组5 只大鼠死亡,存活率为66.67%,2 只造模失败,造模成功率为53.33%;改良组2 只大鼠死亡,存活率和造模成功率均为86.67%。

2.3 MIRI 大鼠心肌损伤的病理情况比较

采用TTC+伊文思蓝染色对三种方式造模24 h及1 周后各组大鼠心肌缺血、梗死面积进行观察。如图3 所示,造模24 h 及1 周后,快速操作组大鼠受手术视野结扎位置所限,缺血梗死面积不统一,快速操作组大鼠受灌注材料方法不同的影响,缺血梗死面积厚度不统一,而改良组大鼠由于手术视野开阔,结扎位置统一,缺血梗死面积较为统一。

图3 TTC+伊文思蓝染色观察造模后大鼠心肌缺血、梗死面积Figure 3 Observation of myocardial ischemia and infarct size in rats by TTC+Evans blue staining

3 讨论

AMI 在发达国家有着“头号杀手”的称号,而随着我国经济的快速发展以及生活方式的西化,使得我国AMI 的发病率和死亡率呈现出逐年递增的趋势[8]。 当心肌缺血时,其代谢模式和超微结构均发生变化,恢复缺血部分的血流量是常用的治疗策略,然而,当血流量恢复时则易导致MIRI 的发生[9]。 MIRI 的概念是由Jennings 等[10]根据组织细胞缺血后获得血液再灌注时,组织细胞缺血所造成的损伤并未得到减轻和恢复,反而加重的病理变化而首次提出的。 MIRI 动物模型的成功建立可为MIRI 的临床治疗以及药物开发提供实验基础,MIRI动物模型的构建研究具有重大的意义,其构建方法多样,但也存在着相应的局限性。

快速操作法及常规开胸造模是目前广泛应用于心肌缺血再灌注模型的造模方法,具有操作较快、方便、视野开阔等优点,但由于快速操作法对于单人手术操作而言要求较高,胸腔外挤出心脏快速结扎时需快速操作,在开胸后2 min 内完成挤出心脏、穿线等过程,且缺血时闭胸难度大,较难将胸腔完全封闭,易气胸导致大鼠死亡。 在实际操作过程中难度较大,不用呼吸机协助死亡率较高。 而常规开胸法因剪断肋骨开口不整齐,在术后的缝合难度大,缝合线稍紧胸腔坍塌压迫肺呼吸,导致呼吸困难,易气胸,且缺血梗死面积较不一致,为后续的指导临床研究、药效评价、细胞治疗等研究带来诸多不利因素。 因此,需要寻找一个快速、高成功率、低死亡率的造模方法。

用于构建MIRI 模型的实验动物种类较多,根据接近人体病理生理的原则对实验动物进行选择,在进化关系上接近人类,基因背景清楚、繁殖周期短、模型重复率高的大鼠在模型制备上具有一定的优势[11]。 本次研究选择SD 大鼠作为MIRI 模型构建的实验动物,在以往造模方法的操作上进行改良,并与上述两种常用方法进行比较。 相较于传统方法,经改良后的再灌注在出血量、创伤、呼吸顺畅、手术视野、操作难度等方面均有较大改善。 因开口由二个撑开器配合撑开胸腔,动静脉小血管没有被切断,出血量微乎其微,垫鱼线缩短了再灌注时的解线再缝合时间,避免二次麻醉导致大鼠生理机能受损,达到了术后最好状态。 闭胸缝合后胸腔完整度很好,避免出现死腔空腔保证了成功率及成活率,在缺血梗死面积及位置也较为统一。

综上所述,本实验主要对大鼠心肌缺血再灌注模型制备过程中进行改进,与快速操作组和常规开胸组相比,具有更高的造模存活率及成功率,对后期心肌缺血再灌注的模型构建具有重要的指导意义。