hTIM4-EGFP 小鼠血液生理生化指标测定

魏 杰,王 洪,刘甦苏,贾松华,熊 芮,王辰飞,范昌发,岳秉飞

(中国食品药品检定研究院,北京 102629)

Tim基因家族(T cell immunoglobulin and mucindomain containing molecules gene family)是一个通过编码免疫球蛋白和粘蛋白分子而在Th1、Th2 细胞表面区别表达的一个基因家族,在机体过敏和肿瘤免疫等疾病中发挥着重要作用[1-5]。

小鼠的Tim基因家族有8 个成员,Tim4 与人的基因高度相似,但只能表达在APC 表面,在人体中Tim4 却可以表达于活化的CD4+T 和CD8+T[6-7]。在小鼠中敲入人源化的Tim4 基因能够更好的研究T 淋巴细胞的调节作用,以及与Tim4 关联密切的哮喘等免疫疾病[8]。

对免疫功能和免疫疾病表现通常伴有血象变化,转基因后的hTIM4-EGFP模型鼠与野生型是否存在差异,以及后期应用于感染实验的血象变化是否来自于基因编辑或是免疫反应,都需要进行血液生理生化指标的前期测定,从而为其应用提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

转基因组hTIM4-EGFP与对照组野生型C57BL/6 各18 只,分别有雌性8 只、雄性10 只,SPF级,体重25～30 g,均来自本单位实验动物资源研究所[SCXK(京) 2017-0005]。 利用自行建立的CRISPR/Cas9 技术将hTIM4 基因定点敲入野生型C57BL/6 小鼠,胚胎注射、转录等操作均在屏障环境中完成[SYXK(京)2017-0013],PCR 检测阳性即为阳性转基因鼠。 转基因组与对照组均饲养于屏障环境[SYXK(京)2017-0013]。

满12 周龄的两组小鼠,空腹12 h 后,采20 μL眼静脉抗凝血加入稀释液中用于测定血液生理指标,取全血分离血清,用于测定血清生化指标。 饲养和实验操作均按照实验动物福利伦理3R 原则规程进行,并经中国食品药品检定研究院实验动物福利伦理审查委员会审批(中检动(福)第(B)021号)。

1.2 主要试剂与仪器

清洗液与溶血剂购自上海东湖生物医学有限公司;碱性磷酸酶等生化检测试剂购自中生北控生物科技股份有限公司。 日本光电Mek7222 血细胞分析仪;日立7080 全自动生化分析仪。

1.3 实验方法

采用日本光电MEK-7222 K 血球分析仪测定22项血液生理指标,仪器精密度:WBC 2.0%,RBC 1.5%,HGB 1.5%,MCV 1.0%,PLT 4.0%。 生理测定项目分别为:白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白浓度(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞分布宽度(RDW)、白细胞五分类计数、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)和血小板分布宽度(PDW)。

采用日立7080 全自动生化分析仪测定12 项血液生化指标:碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、钙(CA)、磷(P)、总胆红素(Tbili)。

1.4 统计学方法

按照品种和性别分类整理数据,用SPSS 软件作独立样本t检验统计分析,结果均以平均数±标准差( ¯x ±s)表示。

2 结果

2.1 生理指标测定结果

转基因组与对照组在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、RDW、PLT、NEUT、LYM%、NEUT%这10 项指标中存在统计学差异(详见表1)。 其中,转基因组在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%这6 项指标上显著低于对照组(P＜0.01),在MCH、RDW、PLT 三项指标上也低于对照组(P＜0.05),在LYM%指标上显著高于对照组(P＜0.01)。

按照性别比较,转基因雌性组与对照雌性组在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC、RDW、PLT、PCT、NEUT、LYM 这11 项指标中存在差异(详见表2)。 其中,转基因雌性组在HCT、PCT、NEUT、LYM四项指标低于对照雌性组(P＜0.05),其余7 项指标上显著低于对照组雌性(P＜0.01)。 转基因雄性组与对照雄性组在转基因组在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%这6 项指标上显著低于对照组,在MCH、RDW、PLT 三项指标上也低于对照组(P＜0.05),在LYM%指标上显著高于对照组(P＜0.01)。 转基因雄性组与对照雄性组在WBC、RBC、HGB、HCT、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%这8 项指标中存在差异。 其中,在RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%五项指标中,转基因雄性组显著低于对照雄性组(P＜0.01),在WBC、LYM 两项指标中低于对照雄性组组(P＜0.05),而在LYM%指标上显著高于对照雄性组(P＜0.01)。

对同组进行组内比较,两组别雌雄间均有7 项指标存在差异。 转基因组雌雄在MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、NEUT、NEUT%存在统计学差异,对照组雌雄间在RBC、HCT、MCV、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%存在统计学差异,详见表2。

表1 hTIM4-EGFP 与C57BL/6 血液生理指标的比较( ¯x ±s,n=18)Table 1 Comparison of blood physiological values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice

表2 hTIM4-EGFP 与C57BL/6 血液生理指标组间差异与性别差异比较Table 2 Comparison of blood physiological values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice in different sexes and groups

2.2 生化指标测定结果

转基因组在ALT、AST、TG、P 这4 项指标上均低于对照组(详见表3)。 其中,在ALT、TG 和P 这3 项指标上显著低于对照组(P＜0.01),在AST 上低于对照组(P＜0.05)。

按照性别比较,转基因雌性组与对照雌性组在ALP、CHO、TG 这3 项指标中存在差异(详见表4)。其中,转基因雌性组在ALP 指标显著高于对照雌性组(P＜0.01),其余2 项指标低于对照组雌性(P＜0.05)。 转基因雄性组与对照雄性组在转基因组在ALT、AST、P 这3 项指标上均低于对照组。

对同组进行组内比较,两组别雌雄间各有2 项和4 项指标存在差异。 转基因组雌雄在ALP 和CHO 存在显著差异,对照组雌雄间在ALT、AST、TP、P 指标上存在统计学差异,详见表4。

3 讨论

实验动物的血液生理生化指标包含了血细胞的分类构成、血清蛋白含量、血糖、酶活力等反应机体内环境稳态的生理代谢参数,反映了个体物质代谢、能量代谢水平,是判断动物健康状态及遗传稳定性等的标准,其测定受到物种、年龄、性别、环境、营养状态、疾病等因素的影响[9-12]。

表3 hTIM4-EGFP 与C57BL/6 血液生化指标的比较( ¯x ±s,n=18)Table 3 Comparison of serum biochemical values of hTIM4-EGFP and C57BL/6mice

表4 hTIM4-EGFP 与C57BL/6 血液生化指标组间差异与性别差异比较Table 4 Comparison of serum biochemical values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice in different sexes and groups

6～8 周龄的性成熟小鼠是开展实验通常选择的实验对象,而12 周龄前后,小鼠的骨生物功能才趋于稳定,骨髓造血也趋于稳定,因此本研究选择了12 周龄的Tim4 转基因鼠与野生型进行比较分析,能够在一定程度反映Tim4 基因敲入对生理生化指标的影响[13]。

从测定的生理指标上分析,无论按照同性别比较或总体比较,除LYM%指标,均存在WBC、RBC、PLT 等主要指标在内的11 项或9 项指标转基因组低于野生型对照组的情况,整体血生理参数与野生型差异较大,但LYM 计数两者并无明显差异,所以在LYM%指标上出现了转基因组高于野生组的情况。 淋巴细胞计数指标尤其可以为研究与Tim基因有关的免疫功能提供借鉴。

从测定的生化指标上分析,转基因组在ALT、AST、TG、P 四项指标上均低于野生型对照组;从同性别比较而言,除转基因雌性组的ALP 高于野生型雌性组外,转基因组雌性和雄性分别在ALP、CHO、TG 以及ALT、AST、P 各3 项指标中低于野生型对应性别组,反映出两者在在肝功、脂代谢以及内分泌功能上均可存在一定差异。

无论生理生化指标,均存在组间差异大于组内差异。 在周龄、饲养等条件一致的情况下,基因敲入可能是导致生理指标差异的最主要因素[14];由于hTim4 基因的转入可能会带来血液生理稳态改变、以及调低肝脂代谢和内分泌等。 该测定建立的血液生理和血清生指标背景资料,为hTIM4-EGFP小鼠的应用研究提供了基础数据。