江永香柚皮水溶性抑菌成分的提取及其在6类食品中的应用

蒋雅茜，胡文锋，李 昕，杨静芸，刘怡君，全沁果

（1.湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南永州 425100；2.湖南省银杏工程技术研究中心，湖南 永州 425100；3.湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南永州 425100）

0 引言

食品行业每年由腐败变质造成的经济损失接近20%[1]，因此，食品的防腐保鲜在食品流通与储藏过程中备受重视。添加食品防腐剂是控制食品劣变的有效手段之一，其效果理想且成本合理，根据其来源不同可归为化学防腐剂和天然防腐剂两类[2]。化学防腐剂是目前防腐剂产品中的主流，其中亚硝酸盐是最具代表性的一类，但已证实亚硝酸盐在人体内可转化为具有致癌性的亚硝胺[3]。天然防腐剂在发挥防腐功能的同时，不仅不会产生对人体健康具有危害的代谢产物，还能为人体提供一定的营养物质，近年来受到了消费者的追捧[4]。目前，天然防腐剂主要取材于动物、植物和微生物等[5]。其中，来源于植物的天然防腐剂由于其资源广阔、分离过程简单、纯度高等特点受到了更多的关注。若将天然防腐剂取材于农产品加工副产物，在保持天然防腐剂上述优点的同时又可缩小与化学防腐剂相比的成本劣势，则具有更高的市场价值。

江永香柚是湖南省永州市江永县经移栽的特有沙田柚品种，和香芋、香姜、香米、香菇并称“江永五香”，种植面积较大，每年有大量柚皮被随意丢弃，造成资源浪费和环境污染[6]。近年来，江永香柚皮、籽中的挥发油、多糖、柠檬苦素等成分得到了科研人员的关注，但其具体活性以及产业化应用还有待进一步研究[7-9]。而该过程需要重点考虑提取活性成分技术路线的放大难度，亦要权衡企业对开发成本的接受能力。为此，本文拟通过响应面法建立江永香柚皮水提参数与提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）抑制作用的模型，并将其应用到液体食品中考察其实际抑菌效果，可为开发液体食品天然防腐剂的选材提供一种新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

江永香柚皮（周边集市收集，经洗净后自然晾干，于60 ℃下干燥至恒重，粉碎过筛后密封储存）；S.aureus，本校微生物试验室保存；盐水溶液，0.15 mol/L的NaCl；酸梅汤、纯牛奶、橙汁、黄豆酱、食用油购于永州市零陵区河西菜市场，珍珠奶茶购于湖南科技学院周边奶茶店；平板计数培养基、营养肉汤基料，购自环凯微生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

01J2003-04型立式压力蒸汽灭菌器筒（上海博迅实业有限公司）、PHS-3C精密pH计（大连中汇达科技仪器有限公司）、DZF-6051型真空干燥箱（上海贺德试验设备有限公司）、WG-71 电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、SW-CJ-2洁净工作台（苏州安泰空汽技术有限公司）、FZ-102 植物粉碎机（上海胜启仪器仪表有限公司）、HWS 智能型恒温恒湿培养箱（宁波市科技园区新江南仪器有限公司），DT5-6A型台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 S.aureus培养物的制备

在无菌条件下挑取适量S.aureus接入50 mL经灭菌的营养肉汤，置于恒温恒湿培养箱中。在200 r/min下培养12 h后，将所得物于4 ℃、10 000 r/min离心5 min，将其经无菌生理盐水洗涤2次后制备成约109cfu/mL的菌悬液备用。

1.3.2 抑菌活性的测定

将干净的滤纸经打孔器统一制成直径约4 mm的圆片，灭菌后分别将其置于提取液和蒸馏水中浸泡30 min，沥去多余的试液后用无菌镊子夹至涂好菌液的培养基平板上（100 μL菌悬液），每个处理组按“+”形对称放置4张滤纸片（平行3次，外加空白对照），于37 ℃下恒温培养24 h，采用游标卡尺十字交叉法测量和计算抑菌圈大小R（扣除滤纸片及空白直径）。

1.3.3 单因素试验

提取的条件为超声时间10 min、提取温度30 ℃、料液比1:10、粒径20目。在此基础上依次研究超声时间（10、20、30、40、50 min）、提取温度（30、35、40、45、50 ℃）、粒径（20、40、60、80、100目）和料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）4个单因素的改变对柚皮水提取物抑菌效果的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验基础上，以抑菌圈大小为响应值，选取影响较大的3个因素超声时间（X1）、超声温度（X2）和料液比（X3）进行响应面试验，以对S.aureus的抑菌圈大小（R）为响应值，试验因素与水平设计见表1，并验证最佳工艺条件。

表1 响应面试验因素水平表

1.3.5 提取物对不同液体食品中S.aureus的抑制作用

分别移取 S.aureus菌悬液 1、2、3、4、5 mL，用经灭菌的生理盐水溶液逐个定容至100 mL容量瓶中，研究江永香柚皮水提物不同用量对盐水溶液（pH 7.0）中S.aureus致死率的变化，进而确定最适用量。分别移取1 mL S.aureus菌悬液和1.3.4中得到的最适用量的江永香柚皮水提物加入到不同液体食品中（共100 mL体系），对照组中添加1 mL S.aureus菌悬液和等量的无菌水，摇匀后于37 ℃下恒温培养。每隔1、2、4、8 h取样检测，计数方法参考 GB 4789.2-2010[10]，采用细菌致死率S评价各体系的抑菌效果：lgS=lg（N/N0）（N、N0分别表示处理后和处理前S.aureus菌落的总数（CFU/mL）[11-12]。

1.4 数据处理

各试验组均平行3次，取其平均值。利用Origin 8.0和Design Expert 8.0.6进行数据分析，并用SPSS 19.0进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1（a）知，江永香柚皮水提物的抑菌效果受超声时间变化的影响最为显著，总体上呈先升后降趋势。超声时间为30 min时，水提物的抑菌效果最好。此时其对S.aureus的抑菌圈为13.21 mm，相对于10 min抑菌效果提高约40.38%。而当超声时间延长至50min时，其抑菌效果约为30 min的84.33%。超声作用能提升破壁效果而促进抑菌成分的溶出，但超声时间过长则会使得抑菌成分的分解效率大于其溶出效率[13]。由图1（b）知，在30～50 ℃的处理组中，当控制超声温度为40 ℃时水提物的抑菌能力最强，其对S.aureus的抑菌圈为10.94 mm；当温度升高至50 ℃后，水提物的抑菌效果明显下降，抑菌圈大小仅为8.92 mm，可能是过高的温度使得江永香柚皮水提物中的抑菌成分受热分解和构象改变[14]。由图1（c）知，粒径的变化对江永香柚皮水提物抑菌效果的影响较小，当粒径达到40目以后，其抑菌圈的变化无显著差异。因此，确定江永香柚皮提取水溶性抑菌成分的最适粒径为40目。

由图1（d）知，料液比达到1:15 g/mL时，继续增加液料比无助于抑菌效果的提升；超过1:20 g/mL后，江永香柚皮水提物抑菌效果的下降程度变得显著，其抑菌圈最低时仅为8.24 mm。加水过少使得提取过程中的有效成分的溶出效率不充分，江永香柚皮抑菌成分不能完全溶出，而料液比过高减少提取溶剂与原料的碰撞频率，还会造成资源浪费，且对后续分离纯化步骤不利[15]。

2.2 响应面试验

固定样品的粒径为40目，选取超声时间、超声温度和料液比3个因素进行响应面试验，结果见表2。

表2 响应面试验方案及结果

由表2可知，采用Design expert 8.0.6软件计算得到抑菌圈（R）对超声时间（A）、超声温度（B）、料液比（C）的二次多项回归模型方程：

2.3 回归模型方差分析

回归模型方差分析结果（见表3）可知，模型的 F=48.25、P=0.000 1，差异极显著；失拟项的P值为0.923 0，差异不显著，说明试验误差在可接受范围内；校正系数R2=0.936 2，说明响应值的变化有93.62%来源于所选因素，即来源于X1、X2、X3，显示模型较为可信；变异系数（CV）仅为3.41%，说明模型有良好的重现性。响应面模型中一次项X1及其二次项X12、X22达到极显著（P＜0.01）；一次项X2和二次项X32达到显著（P＜0.05），其余各项不显著（P＞0.05）。各因素对抑菌圈大小的影响大小为：X1（超声时间）＞X2（超声温度）＞X3（料液比）。

根据回归方程得出不同因子的3D响应面图见图2，曲面的陡峭程度反映了操作条件改变下响应值敏感性的大小[16]，结合回归模型分析知，交互因子对提取物抑菌效果的影响不明显。

2.4 验证性试验

通过Design-expert 8.0.6软件拟合得到最适工艺参数为：超声时间28.19 min，超声温度为39.04 ℃，料液比为 1：15.33 g/mL，预测抑菌圈大小为15.288 7 mm。结合现实中工艺放大的实际需求，最终工艺定为：超声时间28 min，超声温度39 ℃，料液比为1：15 g/mL，粒径为40目。在此条件下进行验证，重复4次，与取消超声辅助提取的试验组进行对照，结果见表4和图3。

表4 提取物的抑菌圈大小

2.5 提取物抑菌条件的确定

图4显示了S.aureus的致死率在盐水溶液中随香柚皮水提物用量增加及处理时间延长的变化规律。S.aureus在盐水体系中的致死率随提取物用量的增加和处理时间的延长而提升，当提取物用量达到3 mL和处理时间超过25 min后，S.aureus致死率的变化基本稳定，由此确定香柚水提物最适用量为3 mL，最适处理时间为25 min。

2.6 提取物对不同液态食品中S.aureus的抑制作用

相对于空白（每个样品组下栏），江永香柚皮水提物对6种不同食品中接种的S.aureus均存在一定抑制作用（具体见表5）。向各样品中加入江永香柚皮水提物后发现，抑菌能力因食品体系不同而差异显著。在奶茶、酸梅汤、食用油、橙汁等固形物含量低的液体食品中其抑菌效果较好，接种至对应体系中S.aureus菌落总数的抑制能力接近或超过3个数量级。而在固形物含量较高的牛奶和黄豆酱中抑制效果较差，分别只减少了0.85和1.78个数量级，原因可能是江永香柚皮水提物在固形物含量高的液态食品中不易扩散所致。

表5 各种液体食品中水溶性抑菌成分对S.aureus的抑制率比较

3 结语

柚皮中被证实具有抑菌活性的功能性成分以多糖、黄酮和精油为主[17-19]。其中水溶性抑菌成分所占比重较高，且开发成本较低。超声波辅助法在植物有效成分提取中已被广泛应用，相对于常规浸提工艺，提取效率显著提高[20]。目前，柚皮活性成分的抑菌试验多建立在培养基的基础上，而考察其在复杂的食品体系中抑菌效果的研究甚少。同时，S.aureus是引起食物中毒最为常见的致病菌[21]。因此，考察抑菌剂在食品中对S.aureus的抑制效果具有现实意义。研究发现，通过优化提取得到的江永香柚皮水提物作为天然抑菌剂在奶茶、酸梅汤、食用油、橙汁中应用前景良好。

本研究发现，江永香柚皮水提物对6类不同食品中S.aureus均有一定的抑制作用，比较适合在酸梅汤、橙汁和奶茶等固形物含量少的食品中应用。研究表明其对食用油中的S.aureus的抑制作用同样较为突出，这是由于试验中对样品的振荡使得该体系形成了乳浊液，而在实际应用中还需进一步研究。迄今为止，江永香柚皮水提物的抑菌成分尚不明确，不同提取态的抑菌效果比较也缺乏数据支持。