荧光光谱法结合分子对接探究咖啡酸与牛血清白蛋白相互作用机制

范金波，安佳鑫，麻 奥，吕长鑫

（1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁锦州 121013；2.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州 121013）

0 引言

咖啡酸属于典型的酚酸类物质，是羟基肉桂酸的一种，在中草药植物杜仲、金银花、仙草和升麻等中常见，在咖啡豆、葡萄酒、卷心菜、橄榄油等中广泛存在[1-2]。咖啡酸，化学名为 3-（3，4- 二羟基苯基）-丙烯酸，易溶于乙醇，微溶于水。研究报道咖啡酸具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性[3-5]。上述研究主要集中在生物活性方面，但是其在人体内的传输机制及其与相关蛋白的相互作用的研究较少。荧光光谱法已经广泛用于小分子与蛋白质相互作用的相关研究，范金波采用荧光光谱法研究了咖啡酸与胰脂肪酶的相互作用，结果表明咖啡酸的加入产生了荧光猝灭，咖啡酸有效地抑制了胰脂肪酶活性[6]。人血清白蛋白是血液中的主要成分，牛血清白蛋白与人血清白蛋白具有高度的同源性，因此试验研究常用BSA代替来研究血清白蛋白与药物的相互作用。BSA是一种单体蛋白由三个结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）组成，每个结构域又包含两个亚结构域（A，B），BSA中两个疏水腔分别在ⅡA和ⅢA，形成两个结合位点 Sudlow's sitesⅠ和 sudlow's sites Ⅱ[7]。当药物进入人体后，通过血浆中蛋白的存储和运输才能到达受体部位发挥其药理作用，因此，研究药物与蛋白的相互作用，有助于了解药物在人体内的传输和分布情况，对于阐明药物的作用机制有非常重要的意义。本文以咖啡酸为研究对象，通过荧光光谱法和分子对接技术研究了它们的相互作用机制，为咖啡酸的进一步开发和应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛血清白蛋白（BSA，99.9%，北京百灵威科技有限公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，99%，阿拉丁试剂有限公司）；2，2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH，99.5%，北京百灵威科技有限公司）；TRIS（北京索莱宝科技有限公司）；咖啡酸 （99.9%，北京百灵威科技有限公司）；硫酸镁、氯化铁、硫酸铜、硫酸锰、氯化钙、浓盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

F-7000荧光分光光度计（日本日立高新技术公司）；KQ-500DE数控超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；KJ-5A多头磁力搅拌器（金坛市科析仪器有限公司）；HH-6数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；ML104/02电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；FE20试验室PH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；UV-2700紫外-可见光分光光度计（日本SHIMADZU公司）；BCD-529WBSN型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；DL-CJ-2N型超净工作台（东联哈尔（北京）仪器制造有限公司）；Milli-Q Reference型超纯水机（德国默克密理博有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 咖啡酸与牛血清白蛋白的荧光光谱研究

在两个1 cm的比色皿中各加3 mL Tris-HCL缓冲液（pH 7.4）然后加入 30 μL 1.2×10-4mol/L的BSA溶液，分别在25 ℃和37 ℃（水浴锅加热）条件下放置5 min。荧光光度计激发和发射狭缝均设定为5 nm，固定激发波长280 nm，在290～450 nm范围内扫描其发射波长，得到荧光光谱。然后向比色皿中依次加入7.2×10-4mol/L的咖啡酸溶液混合均匀（使得溶液中咖啡酸的浓度依次为 0×10-6、1.2×10-6、2.4×10-6、3.6×10-6、4.8×10-6、6.0×10-6、7.2×10-6、8.4×10-6、9.6×10-6mol/L），每次混匀后都分别在25 ℃和37 ℃条件下放置5 min，扫描出荧光光谱。整合后得到25 ℃和37 ℃下的咖啡酸与BSA的荧光猝灭光谱图。

1.3.2 咖啡酸与牛血清白蛋白的同步荧光

在同步荧光光谱试验中，在37 ℃的条件下按照1.3.1的试验方法（溶液的量与浓度均相同），激发和发射波长的差值分别为Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，扫描其同步荧光光谱。整合后得到37 ℃下的咖啡酸与BSA的同步荧光光谱图。

1.3.3 共存金属离子的影响

取用Tris-HCl溶液配制出的100 mL浓度为4.0×10-4mol/L 的 Mg2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+溶液。在37 ℃条件下按照上述试验方法扫描出牛血清白蛋白的荧光光谱，加入0.3 mL配制好的Mg2+溶液混匀放置5 min，上文相同试验方法依次加入20 μL 2.0×10-4mol/L的咖啡酸溶液得出荧光光谱图。然后用相同的试验方法做出Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+的荧光光谱图。

1.3.4 抗氧化活性的测定

1.3.4.1 DPPH法

DPPH在有机溶剂乙醇中是一种稳定的自由基，其孤对电子在517 nm附近有最大吸收值。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性[8]。可用分光光度计进行快速的定量分析。用电子天平称取0.003 9 g DPPH溶于无水乙醇并定容至100 mL作为DPPH工作液。同时用去离子水配制0.05 mg/mL咖啡酸溶液，以及BSA与咖啡酸质量比分别为 5：1，10：1，15：1 混合组溶液作为待测物，分别取2 mL DPPH工作液于5只试管中加入各待测物100 μL，以加入100 μL去离子水作为空白对照，避光静置30 min，然后用紫外可见光分光光度计于517 nm测吸光度，每个样品测定3次[9]。

根据DPPH自由基清除率计算公式：

式中 K——样品对DPPH自由基的清除率；

Ai——加入待测物的吸光度；

A0——加入去离子水作为空白对照组的吸光度。

1.3.4.2 FRAP法

FRAP法常被作为铁离子还原能力指标用于试验之中。Fe3+-吡啶三吖嗪可被抗氧化剂还原为二价铁形式，使得溶液呈现出蓝色，并于593 nm处具有最大吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱[10]。很多文献中都有介绍FRAP工作液的配制方法，按照所述的方法我们配制出3种溶液，然后把3种溶液按照10：1：1的比例配制成FRAR工作液。然后再以去离子水配制的0.05 mg/mL咖啡酸溶液及BSA与咖啡酸质量比分别为 5：1，10：1，15：1 混合组溶液作为待测物，分别取2 mL FRAP工作液于5只试管中加入各待测物 100 μL，37 ℃中放置 10 min，于 593 nm测吸光度。每个样品测定3次。

1.3.5 分子对接

利用Discovery Studio 软件和Autodock vina软件研究咖啡酸与BSA相互作用机制。BSA的晶体结构来源于RCSB PDB数据库（www.rcsb.org，ID CODE：4OR0），4OR0 共 A、B 两条链，提取A链后删除水分、结合物。使用Cdocker进行分子对接，分子对接过程中保持蛋白分子的刚性结构不变，配体构象发生改变，通过计算配体受体之间的非键相互作用，以Cdocker Interaction Energy（-ECD）表示结合自由能，根据-ECD值选取最优构象进行分析，具体对接方法参照文献[11]。

1.4 统计分析

每个试验重复3次，结果表示为Means±S.D.。采用Origin V8.0做图。采用SAS 8.0 软件（SAS Institute Inc.，NC，美国）的一般线性模型（GLM）进行方差分析。邓肯氏多重检验用来确定数据间的差异，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 咖啡酸与牛血清白蛋白的结合反应

牛血清白蛋白分子中内源性荧光主要来自于色氨酸和酪氨酸残基[12-13]。不同温度下咖啡酸对BSA荧光猝灭效应如图1所示。

从图1中可知，两个温度下，随着咖啡酸的逐渐加入，BSA在330 nm的荧光发射峰强度明显减弱，而峰形基本保持不变，呈现出典型的荧光猝灭现象，说明咖啡酸与BSA之间存在着相互作用；不同温度下咖啡酸对BSA的荧光猝灭图谱相似。图中荧光发射波长出现了轻微红移，说明咖啡酸与BSA之间生成复合物，并且复合物的生成使BSA的结构产生了微弱的改变。

荧光猝灭主要包括动态猝灭和静态猝灭2 种类型[14]，动态猝灭过程遵循 Stern-Volmer方程[15-16]：

式中 F0，F——不存在和存在猝灭剂时的荧光强度；

Kq——双分子猝灭常数；

τ0——不存在猝灭剂时荧光体的平均寿命（一般约为 1×10-8s[17-18]）；

Ksv——动态猝灭常数；

[Q]——猝灭剂的浓度。

对于动态猝灭作用，升高温度Kq随之增大；而静态猝灭则相反，温度升高，Kq也将随之减小。由文献可知猝灭剂对荧光分子最大动态扩散猝灭常数为 2.0×1010L/mol/s[19]。由表 1 可以看出两2个温度下猝灭常数均大于2.0×1010L/mol/s，且Kq随着温度的升高而减小。因此，咖啡酸对BSA的荧光猝灭属于静态猝灭，即反应形成了新的复合物。

表1 咖啡酸对BSA荧光猝灭Stern-Volmer方程和猝灭常数

2.2 咖啡酸与牛血清白蛋白的结合常数及结合位点

咖啡酸对BSA的猝灭属于静态猝灭，结合位点和猝灭剂浓度满足以下关系[20]：

式中 Ka——结合常数；

n——结合位点数；

[Q]——咖啡酸溶液的浓度。

以 lg[（F0-F）/F]对 lg[Q]做双对数拟合可以得到咖啡酸与BSA结合的Ka和n值。由表2可知咖啡酸与BSA有很强的结合能力，且只形成了一个结合位点，而随着温度升高，咖啡酸与BSA之间的作用减弱，结合常数与结合位点都减小，此结果与热力学参数相一致，结合反应是放热反应，反应温度升高不利于反应的进行。

表2 咖啡酸与BSA的结合常数和结合位点数

2.3 咖啡酸与牛血清白蛋白的结合作用力类型

小分子与蛋白质分子间的作用力类型包括氢键、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用和共价结合等[21]。根据反应前后的热力学中的焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小可以判断二者之间的主要作用力类型[22]。当温度变化不大时可把焓变ΔH看成一个常量，根据热力学参数方程进行计算：

表3 咖啡酸与BSA结合热力学参数

根据热力学规律：当ΔH＜0，ΔS＞0主要表现为静电作用力或者疏水作用力，且ΔH/ΔG ＞80%，说明焓驱动，作用力以静电相互作用为主疏水相互作用为辅[23]。加之，咖啡酸结构中含有多个羟基，能够比较容易的与BSA之间形成氢键，氢键作用力的大小与分子中的羟基数目存在密切的关联，而结合过程中ΔH的值也说明了分子与BSA之间的互相作用是较弱的。ΔG＜0，可知两者之间的结合反应是自发过程，且二者之间的反应是个放热过程，升温则不利于二者的结合。

2.4 咖啡酸对牛血清白蛋白构象的影响

同步荧光光谱常常用来研究活性分子对蛋白质构象的影响。当Δλ=15 nm、Δλ=60 nm分别显示酪氨酸残基和色氨酸残基特性荧光[24]。酪氨酸残基和色氨酸残最大发射波长与其所处的微环境有关，因此可以考察蛋白质的构象变化[25]。试验中，固定BSA的浓度1.2×10-6mol/L，37 ℃条件下逐渐增加咖啡酸的浓度扫描体系的同步荧光光谱见图2。由图2可知，酪氨酸、色氨酸残基的荧光强度都随着咖啡酸浓度的增加而不断降低，当Δλ=15 nm，酪氨酸残基荧光峰的最大发射波长无明显移动；当Δλ=60 nm时，色氨酸残基的最大发射波长有一定程度的红移，说明BSA内的疏水环境的极性增强，疏水性减弱，肽链的伸展程度有所增强[26]。因此二者的结合影响了BSA的构象，且主要是影响了BSA中色氨酸残基所处的微环境。即在咖啡酸的存在下，BSA的构象发生了变化。

2.5 共存金属离子的影响

人体中金属离子的含量极少，但与人体的生理功能有着密切的关系。研究人体内的主要金属离子对小分子与蛋白质结合的影响非常重。本文考察了 Mg2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+5 种金属离子对咖啡酸与BSA之间相互作用的影响。由表4可知，Mg2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+金属离子的存在不同程度抑制了咖啡酸与BSA的结合，抑制能力排序为Ca2+＞Fe3+＞Mn2+＞Cu2+＞Mg2+。这些金属离子的存在，对咖啡酸与BSA的作用存在竞争作用，二者的结合常数减小，从而减小了药物的释放时间，使得药物短时间内的作用强度增加，这在临床治疗上短时间内提高治疗效果是具有参考价值的。

表4 金属离子存在时对咖啡酸与BSA结合的影响

2.6 BSA对咖啡酸抗氧化活性的影响

抗氧化活性试验中，咖啡酸与BSA结合前后的抗氧化活性变化如图3、图4所示。如图3所示，随着BSA浓度的增加，咖啡酸DPPH自由基清除活性显著性降低（P＜0.05），表明BSA的加入产生了咖啡酸-BSA复合物，复合物的形成掩蔽了咖啡酸的活性基团，进一步证实了BSA与咖啡酸的结合改变了咖啡酸的结构特性，形成咖啡酸-BSA复合物有效地保护了咖啡酸的活性。

通过FRAP法检测BSA对咖啡酸抗氧化活性的影响，其结果见图4。随着BSA浓度增加，吸光度值显著降低，同样验证了BSA与咖啡酸结合后显著影响了咖啡酸的总抗氧化能力。综上可知，体系中BSA与咖啡酸同时存在时，其会发生相互结合，结合反应显著的影响咖啡酸的物理特性，而结合反应后BSA物理特性如何发生变化还有待进一步的研究。

2.7 分子对接

分子对接研究表明多酚与BSA结合位点大部分可能存在于TRP213附近[27]。两种分子模拟方法得到最优构象如表5所示。分子对接结果表明咖啡酸结合位点位于内部疏水区sudlow's siteⅠ（ⅡA），在TRP213附近，位点5Å范围氨基酸残基见表5，可以看出2种模拟方法结果相一致，同样图5（c）表明2种对接方法结合位点基本重合.分子对接与荧光猝灭结合常数的差异主要来源于两种试验不同的相，显然缓冲溶液中溶剂化蛋白与分子模拟中X-ray晶体结构不同。在常态下，BSA三级结构内部含有疏水基团，而极性基团则多出现在表面。氢键可能发生在CA的羟基与BSA的多肽链之间；另外，配体分子的芳香结构在配体-蛋白结合过程中起到非常重要的作用，因为苯基和结合位点内主要疏水氨基酸残基形成疏水相互作用，因此咖啡酸与BSA结合的主要驱动力为氢键、静电相互作用和疏水相互作用，结合位点为siteⅠ，此结果与荧光分析结果一致。

表5 CA-BSA结合位点氨基酸残基及结合自由能

3 结语

论文采用荧光光谱法结合分子对接法研究了咖啡酸与BSA之间的相互作用。研究发现，咖啡酸对BSA存在内源荧光猝灭，通过stern-volmer分析，猝灭属于静态猝灭，即两者结合生成咖啡酸-BSA复合物。热力学分析表明，结合焓增驱动下自发进行，二者结合的主要作用力为离子相互作用。同时利用同步荧光光谱研究了咖啡酸与BSA结合对BSA构象的影响，结果表明二者结合增大了TRP213附近微环境的极性，也就是BSA蛋白疏水区展开。人体内必需金属离子一定程度上抑制了二者结合，从而缩短活性成分的释放时间，临床上具有积极意义。抗氧化活性试验可知两者的结合有效的保护了咖啡酸的抗氧化活性。分子对接结果表明两者结合的主要驱动力为氢键、静电相互作用和疏水相互作用，结合位点为siteⅠ。论文为阐明咖啡酸与蛋白质结合的分子机制，对于开发活性成分有效的递送载体非常重要。