黑米花色苷的pH敏感性及其抗氧化活性研究

（闽南师范大学 生物科学技术学院，福建漳州 363000）

0 引言

黑米（Nigrum rice）是由禾本科植物稻谷经长期培育形成的一类药食兼用的大米。其种植历史悠久，是我国古老而名贵的水稻品种。现代医学也证实黑米具有滋阴补肾、健脾暖肝、明目活血等功效[1]。并且经研究证明，黑米所表现出来的保健功效是来自黑米皮中丰富的花色苷[2]，而不是自身所含有的膳食纤维、维生素和矿物质等营养素，花色苷是在自然界广泛存在的一类黄酮化合物，在大部分植物的根、茎、叶、花、果实和种皮中都有不同比例的存在。随着黑米成熟度的增加，其种皮中的花色苷含量逐渐增加，使黑米的颜色发生由红、紫红、紫黑直至黑的变化。随着近年来对植物花色苷研究的逐渐深入，发现花色苷不仅能够赋予植物不同的色彩变化，还具有抗氧化性、抑菌性、降低血脂等生物活性[3]。在我国，黑米资源丰富，但是目前对其的开发应用方面还较浅[4]，种植者经简单加工便出售，经济效益较低。而黑米中花色苷含量丰富[5]，并且花色苷作为天然的植物色素，安全无害，在食品工业中有广阔应用前景[6]。

试验通过浸提法提取黑米中花色苷，测定不同pH值、不同浓度挥发氨、不同肉类下花色苷的颜色响应，分析黑米花色苷的pH敏感性及其敏感度；以维生素C溶液为对比，测定花色苷抗氧化性强弱。通过这几项测试内容分析黑米花色苷作为添加剂加入pH敏感性食品包装膜的可行性，为黑米的深层次开发与应用提供借鉴，为pH敏感型食品包装膜的研发和制备提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米、猪肉和牛肉购于漳州新华都超市；抗坏血酸（Vc）和 1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）购于上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、乙酸、氯化钾、浓盐酸（37%）、浓氨水（28%）和乙酸钠购于西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

JSM-6010LA扫描电子显微镜（日本电子株式会社）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；MultiSkan Go全波长酶标仪（美国赛默飞世尔有限公司）；NICOLET IS 10傅里叶红外分光光度计（美国赛默飞世尔有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 黑米花色苷的提取

使用粉碎机将黑米粉碎后过40目筛得到干粉状原料，置于棕色试剂瓶中避光保存。使用2%乙酸水溶液与无水乙醇1：1混合作为浸提剂，并与黑米粉按照料液比1：20 g/mL混合，经超声处理30 min，并在50 ℃水浴锅中浸提90 min，取出上清液后经4 ℃、4 000 r/min离心再次将杂质沉淀后经抽滤得到色素浸提液。将色素浸提液与50 ℃下旋转蒸发浓缩，除去浸提液，得到黑米花色苷浓缩液，冷藏避光保存备用。

1.3.2 花色苷含量测定

参照文献[7]以矢车菊素-3-葡萄糖苷为标准物质，利用pH示差法测定黑米花色苷提取物中的花色苷含量。按照式（1）计算花色苷含量。

其中 A=（A513nm-A700nm）pH1.0-（A513nm-A700nm）pH4.5

式中 A——吸光度值；

MW——矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）的相对分子量（449.2 g/mol）；

ε——摩尔消光系数（26 900 L·mol-1·cm-1）；

DF——稀释因子 /V·（Wt）-1。

1.3.3 黑米花色苷对pH值的响应测试

配 制 pH 值 为 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0 的缓冲液备用；将 13份1 mL花色苷浓缩液分别加入到13支10 mL离心管中，分别用配置好的缓冲溶液定容至10 mL，并通过全波长酶标仪作可见光区波段扫描，分析黑米花色苷提取物的吸光特性及其对pH值的响应。

1.3.4 黑米花色苷的智能指示

氨基酸脱羧后产生的胺类物质是食品腐败及微生物生长的重要指标，这些胺类物质主要是氨气、硫化氢及二甲胺等碱性气体，它们能够改变周围环境pH值，从而使花色苷产生不同的颜色变化。本次试验以氨气为腐败特征气体[8]，模拟肉类食品在腐败过程中含氮化合物的挥发，以猪肉、牛肉两种生活中常见肉类为肉类样品，在日常生活条件下进行试验，测试黑米花色苷对氨气、肉类样品的颜色响应，及其对腐败气体的颜色响应灵敏程度，评价黑米花色苷用于对食品腐败进行时时监测的可行性。

（1）黑米花色苷对挥发氨的响应测试。取25 mL花色苷浓缩液定容至100 mL，配置1.484、0.742、0.495、0.371、0.297 mol/L 的氨水，取 5份5 mL花色苷稀释液分别加入到于微量扩散皿内室中，并取以上各浓度氨水5 mL，分别加入上述扩散皿外室中，于通风橱中储藏60 min，每10 min对其做作可见光区波段扫描，探讨随着时间的增长黑米花色苷提取物对挥发氨的响应。

（2）黑米花色苷对肉类腐败气味的响应测试。取25 mL花色苷浓缩液定容至100 mL，取2份5 mL花色苷稀释液分别加入到于微量扩散皿内室中，用分析天平分别称取1份25 g猪肉和牛肉，切碎置于上述微量扩散皿外室中，作3份平行样，于通风橱中常温储藏5 d，每天对其作可见光区波段扫描，分析肉类食品新鲜度对黑米花色苷的影响。

1.3.5 DPPH自由基清除率测定

取10 mL黑米花色苷浓缩液定容至100 mL，配置浓度为0.25 mmol/L DPPH溶液和 50 mg/L维生素C溶液，取18份4 mL DPPH溶液分别放入离心管中，分别取 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL 的花色苷溶液及 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL维生素C溶液放入上述离心管，以只加入4 mL DPPH的离心管作为空白对照，黑暗中静置30 min，做可见光区波段扫描，按式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中 A0——空白对照测得的吸光度；

An——样品测得的吸光度。

1.3.6 花色苷提取物的分子基团及表观形貌分析

通过NICOLET IS10型傅里叶红外光谱仪对黑米花色苷进行全反射傅里叶红外光谱分析（ATR-FTIR）表征黑米花色苷的表面基团，光谱范围为 4 000～650 cm-1，分辨率 4 cm-1，扫描次数64次；使用扫描电镜（SEM）在合适视野中观察黑米花色苷粗提物的微观图像，研究其表观形貌。

2 结果与分析

2.1 黑米花色苷的含量

样品中总花色苷的含量结果如图1所示，经计算，黑米花色苷浓缩液中花色苷含量为86.50 mg/L。

2.2 黑米花色苷颜色对pH值的响应

黑米花色苷颜色对pH值的响应如图2（a）所示。具体来说，如图2（b）～（e）所示，图中吸收峰波长发生了4次明显变化，分别对应了不同pH值下花色苷4种结构的转变：从pH1.0～4.0时，吸收峰位置出现在520 nm左右，这是由于花色苷以红色的花色烊阳离子形式存在导致的；随着pH值的不断增大，其在520 nm处的吸收峰强度逐渐降低，这是由于花色烊阳离子结构的减少且逐渐转化为无色的甲醇假碱和查尔酮假碱导致的[9]；当pH值上升至7.0时，花色烊阳离子结构几乎完全消失，花色苷最大吸收波长发生红移图2（c）；当pH值达到8.0时，溶液呈黄绿色，花色苷最大吸收波长在600 nm左右，这是由于花色苷转变为蓝色醌式结构同时其芳环上发生甲基化反应，使花色苷产生了黄色物质[10]，且随着pH值继续上升，花色苷颜色逐渐变向黄色转变，最大吸光度随之上升图2（d）；当pH值继续上升至9.0～13.0时，溶液变为黄色，在600 nm处的吸收峰随着pH值的上升其吸光度逐渐降低，这表明了在强碱环境下，花色苷的醌式结构不稳定，会形成共振稳定的醌式阴离子[11]。

2.3 黑米花色苷的智能指示

2.3.1 黑米花色苷对挥发氨的响应测试

图3是黑米花色苷在不同浓度氨水下的可见光谱变化。如图3所示，随着时间的增加，扩散皿内部的NH3浓度不断增大，皿内环境pH值逐渐升高，黑米花色苷分子结构转变为以红色的花色烊阳离子为主，导致其吸光度在520 nm处有强的吸收峰，而当NH3浓度继续增大时，黑米花色苷开始以查尔酮或醌型碱结构为主[12]，而花色烊阳离子逐渐减少，故出现吸收峰达到最高后下降并且最大吸收波长发生红移的现象。在浓氨水稀释程度增加时，虽没有出现最大吸收波长发生红移的现象，但是随着时间的延长，NH3浓度的逐渐增大，黑米花色苷仍会产生明显的颜色变化，说明其能够根据食品腐败气体不同浓度发生灵敏的智能指示[13]。

2.3.2 黑米花色苷对肉类腐败气味的响应测试

如图4所示，黑米花色苷对猪肉和牛肉的吸光值响应基本一致，贮藏前2 d在520 nm处的吸收峰逐渐降低，伴随着花色苷红色逐渐褪去，说明花色苷此时的红色烊阳离子结构正在逐渐减少[14]，转变为甲醇假碱和查尔酮假碱等无色物质。随着猪肉和牛肉腐败程度的增加，黑米花色苷的花色烊阳离子结构几乎完全消失，其最大吸收波长发生红移，随后吸收峰也继续降低，花色苷颜色也转变为黄绿色，说明其形成蓝色的醌式结构，并且结构中一芳环发生甲基化，使花色苷转变为黄色[15]。因此黑米花色苷能够根据食品腐败程度展现出不同的颜色变化。

2.4 黑米花色苷的DPPH自由基清除能力

从花色苷溶液和维生素C溶液对DPPH·的清除能力（如图5）发现，在自由基清除剂加入的1 min内，离心管中溶液颜色便随着清除剂添加量的增加而逐渐变浅。由图可知，两种自由基清除剂的DPPH·清除率均随着剂量的增加而增加，经计算可以得出，黑米花色苷和维生素C对DPPH·清除率的 IC50 值分别为 4.462 μg/L、34.56 μg/L，通过比较得出，黑米花色苷的DPPH·清除能力远高于维生素C，且在所选添加量范围内，DPPH自由基清除率与花色苷添加量呈正相关，随着花色苷浓度增加，对DPPH自由基的清除能力能达到70 %以上。

2.5 黑米花色苷的表观形貌

如图6所示，由于黑米花色苷结构中含有苯环及与苯环连接的多个糖基上的羟基伸缩振动，导致了红外图谱在3 340 cm-1有一强而宽的吸收峰，并且羟基间形成了氢键，故吸收峰的波形逐渐变宽，并逐渐向低频移动。

图中2 979 cm-1处的吸收峰是由糖基上的亚甲基伸缩振动引起的；在1 644 cm-1处的一吸收峰则为共轭羰基的伸缩振动特征峰，对应了苯环上的α-羰基结构，由此可以看出黑米花色苷中存在有酰基基团[16]。1 455，1 415 cm-1处则对应了花色苷中苯并吡楠的芳环和杂环的骨架振动。1 383，1 327，1 273 cm-1处的一系列吸收峰对应了黑米花色苷糖环上碳氧键的伸缩振动。因此，初步判断黑米花色苷是一种苯环结构上存在-OH基和-OCH3基团并与一个氧杂原子的六元杂环组成的具有一定酰基化的化合物。黑米花色苷分子表面存在大量多糖交联结构，粗糙不平，褶皱丰富，大大增加了其表面积，从而使黑米能够更灵敏的与腐败气体反应，起到更好的智能指示作用[17]。

3 结语

本试验以浸提法提取黑米花色苷，其粗提物浓缩液含量为86.50 mg/L；对黑米花色苷进行pH响应试验，发现黑米花色苷对pH值敏感，能够随着不同的pH值展现由紫红到红、无色、绿以及黄绿的颜色变化。使用氨气为腐败特征气体，模拟肉类食品在腐败过程中含氮化合物的挥发，以猪肉、牛肉两种生活中常见肉类为肉类样品，在日常生活条件下进行试验，测试黑米花色苷对氨气、肉类样品的颜色响应，发现黑米花色苷能够通过挥发性氮含量的增加而发生不同程度的颜色变化。对黑米花色苷进行自由基清除能力试验，以维生素C为对照，根据两种抗氧化剂对DPPH·的清除率计算得出，黑米花色苷和维生素C溶液对DPPH·清除率的IC50值分别为4.645 μg/L、34.56 μg/L，发现花色苷清除DPPH自由基能力强于维生素C，因此黑米花色苷具有很强的抗氧化性能。通过红外光谱和电镜观察黑米花色苷的表观形貌，可以看出黑米花色苷是一种苯环结构上存在-OH基和-OCH3基团并与一个氧杂原子的六元杂环组成的具有一定酰基化的吡喃化合物，并且由于其结构的特点能够更好地发挥对食品新鲜度进行实时监测的作用[18]。

因此，黑米花色苷作为天然色素，来源丰富，安全性系数高，拥有较好的抗氧化能力。能够起到防止食品腐败变质，延长其保质期的作用[19]。同时，黑米花色苷能够根据食品新鲜度的变化展现出不同的颜色变化。有望将其应用于pH敏感型智能活性食品包装膜的制备中，起到对食品进行保鲜和新鲜度智能指示的作用[20]，方便消费者辨别食品新鲜度，为黑米花色苷的开发应用提供参考依据。