鹅源性沙门氏菌分离鉴定及中药抑菌效果分析

岳学青，高炳南，周瑞进，王秋菊，崔一喆

（黑龙江八一农垦大学，动物科技学院，大庆 163319）

鹅沙门氏菌病又称为鹅副伤寒，为革兰氏阴性菌感染，其传播迅速致病率高，发病鹅往往生产性能低下甚至引起死亡给养殖业带来了巨大的损失。临床剖检可见肝脏肿大并伴随出血现象，盲肠充满白色分泌物[1]。据刘敏芳[2]做的鼠伤寒沙门氏菌感染鹅的实验可知感染的6只鹅2 d内死亡4只可见沙门氏菌病在鹅养殖业的危害是巨大的。目前对细菌性疾病的诊断主要通过细菌分类鉴定生化实验以及较为准确的PCR[3]。近年来由于抗生素的无节制使用造成细菌演化出多重耐药菌株，其耐药性越来越强给人类生产活动尤其是食品卫生方面带来了很大危机[4]。而中药却具备绿色，环保，长期使用不易产生耐药菌株的特点，所以在近年国家大力提倡禁止使用抗生素的大环境下，越来越多的学者开始在中药抑菌方面做出探索。例如司春灿[5]在不同中药对大肠杆菌的研究中提到不同提取方式对中药抑菌效果的影响。赵娜[6]在黄连等六味中药对耐药性鲍曼不动杆菌的抑菌作用研究中提到中药具有良好的抑菌效果。另外中药在诱导肿瘤细胞凋亡方面具有良好前景，例如肉豆蔻酸可以诱导乳腺癌癌细胞、前列腺癌癌细胞、胃癌癌细胞、肝癌癌细胞等。并且在Xiangrong Chen[7]的研究中证明了肉豆蔻具备破坏细菌细胞膜，破坏细菌DNA使其裂解，从而降低耐药性的作用。在Q.Y.Zhao等[8]研究报道中黄芩可以降低细菌耐药基因的表达以此来降低细菌耐药性。在食品添加剂方面，中药作为一种天然的食品防腐剂，很少被用作食品添加剂。研究可以为中药作为天然食品防腐剂的研究提供理论依据。

1 材料

1.1 试验仪器与试剂

亚硫酸铋琼脂（BS）、血平板、营养琼脂（青岛高科园海博生物技术有限公司）、肠道菌增菌肉汤（EE）、PCR仪、球磨仪、恒温水浴锅、低温离心机、细菌基因组DNA提取试剂盒（海基生物科技有限公司）、牛津杯、紫外分光光度计。

1.2 试验药物

2 试验方法

2.1 菌株的制备及培养

为了更好实施临床对鹅源性沙门氏菌的特异性调控，在病原体的识别提取方面就显得尤为重要。试验所用菌株采集于黑龙江省狮白鹅发病幼鹅的新鲜粪便。准备6支无菌试管分别标记上10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。称取 1 g 新鲜粪便于 10-1号试管内，并在6支试管内分别加入9 mL PBS。充分混匀后10-1号试管后吸取100μL置于10-2号管内充分混匀再吸取100μL到下一个管以此类推，至10-6号管，舍去100μL。稀释好的菌液进行特异性培养，取3个无菌平养皿制备亚硫酸铋琼脂培养基（BS）分别标记10-4、10-5、10-6分别吸取对应试管内稀释的菌液20μL用玻璃棒进行涂布此过程在超净台内进行37℃恒温培养箱培养18 h观察生长情况。将优势沙门氏菌株接种在营养琼脂斜面37℃恒温培养12 h。并制备含菌营养琼脂平板观察其菌落状态。从琼脂斜面上勾取优势菌株进行血平皿涂板及革兰氏染色镜检。

2.2 中药的制备

根据白东东等[9]对中药提取的报道，现将黄芩、诃子等25味中药进行研磨粉碎。称取3 g药粉于无菌试管内，加入70%酒精30 mL常温过夜。次日将浸泡好的中药400 W超声波震碎30 min，1 200 rpm离心10 min取上清，70℃～80℃水浴浓缩至3 mL，121℃高压灭菌15 min 4℃冷藏保存。

2.3 PCR法鉴定

2.3.1 引物的设计及合成

引物依据王警等[10]报道的引物合成方法，即根据GenBank所提供的沙门氏菌的基因序列，在生工生物技术有限公司进行引物的设计纯度级别为PAGE。设计出的上游引物命名为：InvAF5’AAA AGA AGG GTCGTCGTT AG 3’下游引物命名为 InvAR：5’GGA AGG TAC TGC CAG AGG TC3’。

2.3.2 PCR扩增的DNA模板

将各致病菌株分别接种到肠道菌增菌肉汤培养基中，37℃，160 rpm摇床过夜培养，使菌液终浓度达到1×108CFU·mL-1。吸取培养好的菌液5 mL，10 000 rpm离心5 min尽量吸取上清丢弃，依据HaiGene海基生物科技有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书对鹅源沙门氏菌的DNA进行提取，提取沙门氏菌DNA作为荧光定量PCR模板，也可直接选用菌液作为PCR的模板，存放于-20℃。

2.3.3 PCR体系

试验的PCR体系为20μL如表1所示。

1.2.2 问卷调查 采用护士工作满意度量表(中文版)［2］，包含15个项目的Likert量表，答案分为5个级别，即“非常不满意、不满意、一般、满意和非常满意”，分别按1～5分计分，得分越高表示满意度越高。该量表的信度(Cronbach’α系数)为0.88。每次应急人力调配后1周，由护理部科研成员对相关科室护士讲解测试目的后填写问卷，并当场收回。共发出问卷171份，回收问卷171份，回收率100%。

2.3.4 PCR扩增程序

如表2所示为试验PCR的反应程序。

2.3.5 PCR产物的鉴定

用1×TAE缓冲液加EB（荧光素，溴化乙锭）1μL配制质量浓度为0.1 g·L-1的琼脂糖凝胶。吸取PCR扩增产物2μL，buffer 0.5μL混合后加入琼脂糖凝胶孔内，电泳30 min。用紫外凝胶成像系统拍摄电泳结果，分离菌株与预期条带 345 bp左右一致，即为沙门菌阳性[11]。

表1 PCR扩增体系Table1 PCR amplification system

表2 PCR反应程序Table2 PCR reaction procedure

2.4 沙门氏菌的游离性鉴定

勾取琼脂斜面上的沙门氏菌于改良MSRV培养基上42℃恒温培养12 h。观察其是否有游离性。

2.5 菌悬液的制备及菌浓度的确定

勾取琼脂斜面上单株菌落接种于肠道菌增菌肉汤内，37℃恒温培养18 h。将培养好的菌液进行40倍、50倍、60倍、70倍等梯度稀释。使用紫外分光光度计将菌液浓度调定为1×105CFU·mL-1。吸取稀释好的菌液与等量甘油1∶1进行混合，-80℃保存。

2.6 各类中药的MIC

试验采用传统的二倍稀释法，准备好96无菌培养孔板，先在第1列加入180μL肠道菌增菌肉汤（EE），在第12列加入200μL肠道菌增菌肉汤（EE）。在2-11列加入100μL肠道菌增菌肉汤（EE）。将保存备用的各种中药提取液20μL分别加入到第一列，用排枪充分吹吸混匀后吸取100μL混合液到第二列，第二列混匀后再吸取100μL至第三列，直到第10列混匀后吸取100μL舍去。第1-11列放入稀释好的菌悬液100μL。此时无菌培养板中第 1～10 列中药浓度分别为 50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 mg·mL-1。37 ℃恒温培养箱内培养24 h。第11列为阳性对照组（添加培养基和菌悬液），第12类为阴性对照（仅培养基）。将肉眼观察最清亮孔的最小浓度定义为最小抑菌浓度（MIC）。若96孔板上出现跳孔则操作不正确需要重新进行试验。每类中药做3次重复。

2.7 牛津杯法体外抑菌试验

依据刘德成[12]提供的牛津杯法抑菌试验：无菌条件下制备NA培养基，待培养基冷却后，吸取20μL菌悬液均匀涂抹于平板上静置1h制成含菌平板。用镊子夹住牛津杯放在酒精灯外焰上灼烧，待牛津杯上的冷烟由下向上走过即可平稳的将其置于含菌培养基上，其内加入80μL药液，置于37℃恒温培养箱内培养12 h，测量其直径。抑菌圈直径＞15 mm为高敏，10 mm≤抑菌圈直径≤15 mm为中敏，抑菌圈直径＜10 mm为不敏感或耐药。

3 结果

3.1 菌株在各培养皿上的生长状态

沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂（BS）上生长为黑色菌落有金属光泽，菌落光滑湿润，边缘整齐圆形如图1，在营养琼脂平皿上生长为无色大菌落，光滑圆润，半透明，乳白色，这与李柏林[13]所报道的一致。如图2所示。在改良MSRV培养基上有白色迁移现象如图3所示。在血平板上生长出现溶血环如图4。经革兰氏染色鹅沙门氏菌为红色，革兰氏阴性菌，多呈散状存在如图5。根据几种培养基的特异性培养初步鉴定为本次所提取的菌株为鹅源性沙门氏菌。

图1 亚硫酸铋琼脂（BS）Fig.1 Growth of bacteria on bismuth sulfite agar

图2 营养琼脂（NA）Fig.2 Growth of bacteria on nutrien agar

图3 改良MRSVFig.3 Growth of bacteria on Improved MRSV

图4 血平板Fig.4 Growth of bacteria on Blood plate

图5 细菌革兰氏染色Fig.5 Schematic diagram of bacterial Gram staining

3.2 琼脂糖凝胶电泳结果

如图6所示，第M孔为Marker，第1～2为菌通用型引物扩增条带。第3孔和第4孔为试验特异性沙门条带：经过琼脂糖凝胶电泳后，送公司进行测序。通过NCBI数据库进行同源性在线比对，以此确定菌种属种。结果显示特异性纯化的菌为鼠伤寒沙门氏菌。

图6 琼脂糖凝胶电泳结果示意图Fig.6 AGEresult

3.3 各类中药MIC

如表3所示：在25种中药试验中五倍子、诃子、乌梅、黄连、防风、辛夷对鹅源性沙门氏菌拥有良好的抑菌效果。绝大多数中药都在试验中对鹅源性沙门氏菌表现出抑菌性，因为每种中药的炮制方法不同各种成分的提取量也不尽一致。故试验统一采用了酒浸的方式虽然部分中药效果不是很好，但这不足以说明这几种中药对鹅源性沙门氏菌抑菌效果不好，只能说明在酒浸这种炮制方式下这几种中药对鹅源性沙门氏菌的抑菌效果不如五倍子、诃子、乌梅、黄连、防风、辛夷这几味中药。

表3 中药药敏试验Table 3 TCMdrug susceptibility test

3.4 牛津杯体外抑菌效果

由表4可知五倍子、乌梅、诃子、防风、黄连、车前子对鹅源性沙门氏菌呈现高度敏感。野菊花、黄芩、辛夷对鹅源性沙门氏菌呈现中度敏感。知母呈现低度敏感。

4 讨论与分析

试验从中药抑菌角度出发，进行了菌的鉴定及中药的酒浸提取物抑菌试验。结果显示中药在抑制鹅源性沙门氏菌上是普遍有效果的。其中五倍子、乌梅、诃子、防风等对鹅源性沙门氏菌呈现出较高的敏感度。野菊花，黄芩等则表现出中度抑菌敏感。虽然在体外抑菌实验中，中药在对鹅源性沙门氏菌表现出良好的抑菌效果，但其并不能代表筛选出的这几味中药对临床治疗的效果。要想知道其临床治疗鹅源性沙门氏菌引起的疾病的治疗效果还需进行动物性试验。因沙门氏菌分2 579个血清型所以中药在众多血清型的抑菌效果还有待探讨[14]。我国在探索中药抑菌方面具有悠远的历史，从20世纪40年代开始，就有无数的中药体外抑菌实验不断地开展，直至现在大量试验的均证明中药是具有抑菌作用的[15]。另外中药具有疗效好，副作用小，价格低廉不易产生耐药性等特点，在未来一定会被广泛应用[16]。虽然多数实验均是在单味中药的基础上开展的，但中药来源广泛，种类繁多。而且众多的中药之间的相互配伍是不容忽略的。据葛海燕[17]在对中药对藏香猪源致病性大肠埃希菌地方流行株中体外抑菌效果试验中通过测定敏感药物体外联合抑菌指数FICI，结果表明，诃子、黄连、诃子+白头翁2种中药组合对抑菌效果产生协同作用，而诃子、五倍子、五味子+黄连、五味子+白头翁3种中药的组合对抑菌效果具有相加作用，因而证实了这几种中药可以组合在一起，提高其抑菌效果。而五味子+五倍子组合有拮抗作用，降低其抑菌效果。证明这两种中药是不能联合使用的。所以在联合用药方面还需要做进一步的研究。近代以来随着抗生素的大范围使用，细菌出现大量的耐药菌株。耐药菌可以通过防止吞噬细胞吞噬或消除吞噬细胞内的活性氧等方式来逃避先天性免疫反应，从而产生耐药性[18]。研究表明药物抗耐药菌作用方面具有突出作用的机制大致可分为以下几类，可通过消除细菌内有耐药性基因的质粒从而消除细菌的耐药性。抑制细菌外排泵从而降低细菌耐药性，还可以通过改变细菌的细胞膜的通透性来降其耐药性[19]。在Wooseong Kim[20]报道的药物通过附着、嵌入、渗透进入细菌磷脂双分子层，从而改变磷脂双分子层的流动性，加速细胞膜完整性的破坏最终致使细胞膜破碎，核酸裂解细菌死亡。在申春红[21]的益生菌发酵复方中草药对肉鸭生长性能和屠宰性能中提到，经益生菌发酵后的中草药可提高肉鸭的生长性能和屠宰性能。由此可见在中药不同炮制方法下药效及功能都是迥异的，中药的可开发程度是深远的。中药在治疗预防疾病方面本就有着不可替代的作用，其抑菌机理的研究和药物运用方面的探索是我们今后研究的重点和方向。

表4 中药对鹅源性沙门氏菌的牛津杯抑菌检测结果Table 4 Antibacterial test resultsof traditional Chinese medicine on Oxford Cup of Goose-derived Salmonella

针对鹅源性沙门氏菌病这类家禽传染病其传染力强，传播速度快，破坏力强给家禽养殖业带来不可估量的损失，在提高预防措施这方面就显得尤为重要。为此应该从以下几个方面进行防御措施：第一，提高防疫意识，加强饲养者和组织管理者的技术培训，做好防御安全宣传知识的到位。第二，制定合理的饲养管理模式，在科学的理论下知道实践并不断总结经验教训使之达到规模化科学养殖。第三，加强饲养环境卫生的管理，及时清除动物粪便等可能滋生细菌的东西。做好防止鼠类鸟类等的进入饲养环境造成食源水源的污染。第四，做好防疫工作，及时合理的对家禽接种疫苗。