超高压辅助提取黑豆花青素的工艺优化研究

姜秀杰 ，张爱武 ，姜彩霞 ，张桂芳 ，张东杰 ，

（1.黑龙江八一农垦大学/国家杂粮工程技术研究中心，大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学/黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室）

黑豆（Semen glyane）是豆科植物，又称黑大豆、乌豆，是东北地区主产作物，其适应性强，产量高，且耐旱、耐盐碱等特点[1]。黑豆中含有不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，还有黄酮、皂苷、花青素等活性成分，使黑豆具有多种生理功能，如乌发明目、补肾养血、祛风除热、抗氧化、降血糖、抗炎和抗癌等作用[2]，现已成为功能食品及药品开发的重要资源，尤其黑豆色素已成为学者的研究热点，它是一种色泽鲜艳、易溶于水、味道微甜，且有益于人体健康的活性物质。花青素作为色素主要成分，属于生物类黄酮物质，是由黄烷-3-醇和黄烷-3，4-二酚的配位缩合或聚合而成低聚或多聚物[3]，具有双重抗氧化活性，不仅能产生具有抑制氧化反应的代谢物质，还能能捕捉自由基的原儿茶酸[4]，可清除体内大量自由基；花青素除具有抗氧化性之外，还具有缓解疲劳[4]，神经保护作用[5]、保护视力[6]、抗高血压及降糖等生物活性，Bagchi D[7]、周翠[8]、Bridle P[9]、肖珍[10]等研究发现花青素的抗氧化能力是 VE的50倍，是VC 20倍左右。总之，花青素是一种维持人体健康，预防相关疾病的重要活性物质，具有抗氧化性强、安全无毒、易溶解的特点，是迄今为止发现的最好天然抗氧化剂之一，在功能食品及药物开发领域中，具有较好的应用价值。

目前，关于花青素的提取，一般采用溶剂提取法、酶提取法和CO2超临界萃取法等。溶剂提取法操作简单，但存在提取时间长、溶剂消耗量大，提取率低等缺点[11]，其他酶法和超临界萃取法等技术普遍存在耗能成本高等问题。超高压技术属于一种非热加工技术，2004年首次被用于天然植物有效成分的提取[12]，与传统提取方法相比，超高压提取所需时间最少、作用温度低、保持了食品原有品质和提取率高等优势，已在天然产物提取方面得到了初步应用[13]，但有关黑豆花青素提取方面的应用报道较少，因此选用超高压技术。以黑豆粉为原料，采用响应面分析法优化黑豆花青素的提取工艺，以期为超高压技术在黑豆花青素提取方面的深入研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小黑豆（产自黑龙江省青冈县，购买于大庆市昆购超市）；

原花青素标准品：北京索宝莱科技有限公司；上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、香草醛、甲醇、盐酸等试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

DFY高速万能粉碎机（上海左乐仪器有限公司）；UV721紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；RE-25A旋转蒸发器（上海科升仪器有限公司）；超高压设备、超高冷等静压机（上海大隆超高压设备有限公司）；FX202-0电热恒温干燥箱（郑州宏朗仪器设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线绘制

显色剂组成A∶B=1∶1，其中试剂A为甲醇溶液，配制方法为精确称取1.000 g香草醛于100 mL烧杯中，加适量蒸馏水溶解后，定容于100 mL容量瓶中；试剂B也是甲醇溶液，量取8 mL浓盐酸稀释后，定容于100 mL容量瓶中。

参照香草醛－盐酸法测定黑豆中原花青素的含量。精确称取10 mg的原花青素标准品，然后用蒸馏水稀释，配制成浓度为0.1 mg·mL-1标准溶液。吸取不同毫升的标准品（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9）放置于 10 mL容量瓶中，添加5 mL AB显色剂，再用1%盐酸甲醇溶液定容至刻度线，摇匀后放置在30℃恒温水浴中水浴30 min，选择甲醇为空白对照，在530 nm波长处测定各组分吸光度值，之后以原花青素浓度作为X轴，吸光度作为Y轴，绘制其标准曲线，并计算分析得到其回归方程为Y=0.962 X+0.048，R2=0.996 4。

1.3.2 黑豆样品前处理

黑豆清洗干燥到恒重，然后用高速万能粉碎机粉碎过60目筛，真空包装，放置在-21℃冰箱中保存，减缓黑豆粉末氧化，留存备用。

1.3.3 超高压提取黑豆花青素工艺

称取前期自制的黑豆粉末1.0 g，放入聚乙烯袋中，加入一定量乙醇（40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇-1%盐酸溶液），真空包装封口后进行超高压处理。在常温条件下，超高压处理压力依次为100、200、300、400、500、600 MPa，保压时间依次为 2、4、6、8、10、12 min，料液比（g·mL-1）依次为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。按照上述乙醇浓度、处理压力、保压时间、料液比4个因素设定的条件对黑豆粉样品进行处理，对处理样液进行过滤后，离心处理10 min（3 000 r·min-1），取其各自上清液，将提取液定容至等体积后，用紫外分光光度计于波长530 nm处分别测定各样品的吸光度值。

1.3.4 响应面试验设计

根据单因素试验，按照Box-Behnken Design中心旋转组合设计原理，选取乙醇浓度（A）、高压压力（B）、保压时间（C）、料液比（D）四个因素，以黑豆花青素的提取率为响应值，建立四因素三水平的回归模型，对超高压辅助提取黑豆花青素的工艺参数进行优化，其因素水平设计表见表1所示。

表1 因素水平编码表Table 1 Factors and levels table

1.3.5提取率计算

吸取1.0 mL上述处理得到的黑豆花青素提取液，放置在25 mL容量瓶内，用蒸馏水稀释值刻度线，在530 nm处测定其吸光度值，然后根据前面标准曲线来计算提取液中花青素的含量[14]。

式中：C代表花青素的浓度（ug/mL）；V代表定容时消耗的体积（mL）；n代表稀释倍数；M为黑豆样品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

（1）乙醇浓度对提取率的影响

花青素类物质中存在酸性和碱性基团，因此具有溶于水、甲醇、乙醇、稀碱和稀酸等极性溶剂的性质，但不溶于有机溶剂如 乙醚、氯仿等[14]。从食品安全角度出发，该实验选择乙醇作为提取溶剂，并考察了不同乙醇浓度对超高压辅助提取花青素效果的影响，其结果如图1所示。

图1 乙醇浓度对黑豆花青素提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of anthocyanin from black bean

由图1可知，随着乙醇浓度的不断增加，黑豆花青素的提取率也不断增大，当乙醇浓度为70%时，提取率最大，之后持续增加乙醇浓度，提取率反而下降。分析其原因，可能是当乙醇浓度过大后，其极性随之降低，导致花青素类物质的溶解性也随之减弱，同时还可能产生一些醇溶性杂质，进而影响了花青素的提取效果，因而选用乙醇浓度范围在60%～70%之间效果较好。

（2）不同压力对黑豆花青素提取效果的影响

常温状态下，乙醇浓度为50%，保压时间为4 min，料液比为1∶30的提取条件下，考察不同超高压压力对黑豆花青素提取效果的影响，其结果见图2所示。由图可知，随着压力的升高，提取率不断增加，当压力达到400 MPa时，花青素提取率达到最大值，之后压力再升高，提取率反而下降。出现这种现象的原因，可能与超高压工作原理有关，当压力达到一定值时，会导致细胞器、细胞壁、细胞膜受损，使细胞渗透能力增加，有利于提取溶剂进入到细胞中，将黑豆中有效成分渗透到细胞外，进而达到提高黑豆花青素提取率的目的[15]。在一定压力范围内，压力与提取率呈现正相关，即压力越大提取效果越好，但压力过大时，提取率反而下降，因其高压可能破坏花青素的结构或者导致其他物质生成，进而影响花青素的溶出，因此，最适压力范围确定为300～500 MPa。

图2 不同压力对黑豆花青素提取率的影响Fig.2 Effect of different pressure on extraction rate of anthocyanin from black bean

（3）保压时间对黑豆花青素提取效果的影响

在超高压压力为300 MPa、乙醇浓度为分65%、固液比为1∶30的条件下，考察保压时间分别为 2、4、6、8、10和12 min时，对黑豆花青素提取效果的影响情况，其结果如图3所示。由图3可知，花青素的提取率随着时间的增加而增加，当保压时间达到6 min后，虽持续增加保压时间，但黑豆花青素的提取率并无明显升高。这是由于超高压可引起溶剂的渗透与溶质的溶解快速达到平衡，使超高压辅助提取法可在短时间内迅速将目标成分提取出来，并能快速达到提取终点。这种现象和陈静雯等[16]报道的超高压提取天然产物有效成分的特点相符合。

图3 保压时间对黑豆花青素提取率的影响Fig.3 Effect of pressure holding time on the extraction rate of black bean anthocyanin

（4）料液比对黑豆花青素提取效果的影响

在其他提取条件一定下，考察料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60） 对黑豆花青素提取效果的影响，其结果如图4所示。由图4可知，随着料液比从1∶10增加到1∶30，花青素提取率也随之不断增加，当料液比达到1∶30以后，其提取率达到最大，且不在随料液比的增加而增大。这可能是初始的提取溶剂较少，使黑豆物料在溶解过程中，容易达到饱和状态，减缓花青素的溶出；但随着提取溶剂的不断增加，使溶质与溶剂达到饱和状态的程度减弱，有利于花青素的溶出，因此，在此阶段，提取率有所提高；当溶质达到溶解平衡状态时，得率将不再增加，这与马燕等报道的超高压辅助提取辣椒红色素的研究结果相似。综上分析，选择最适料液比为 1∶30、1∶40 和1∶50作为下一步的工艺优化研究的参数。

图4 料液比对黑豆花青素提取率的影响Fig.4 Effect of liquid ratio on the extraction rate of black bean anthocyanin

2.2 响应面优化结果与分析

2.2.1 模型建立与显著性分析

通过Design-Expert8.0软件中Box-Behnken模式对黑豆花青素提取工艺进行设计，选取乙醇浓度、料液比、处理压力、保压时间4个因素进行优化，以提取率为响应指标，具体设计方案及结果见表2所示。

表2 Box-Behnken方案及结果Table 2 Box-Behnken protocol and results

续表2 Box-Behnken方案及结果Continued table 2 Box-Behnken protocol and results

利用Design-Expert8.0.6软件对实验结果进行多元回归分析，得到回归方程：

Y提取率=+3.27+0.090A+0.37B+0.10C+0.20D-0.14A*B+0.47*A*C+0.44*A*D-0.15*B*C-0.24*B*D-0.034*C*D-0.58*A^2-0.41*B^2-0.71*C^2-0.56*D^2

对建立的回归模型进行显著性分析，其结果见表3所示。从表3可以看出，回归模型的F值=11.78，P＜0.000 1，说明模型极显著，失拟项P值=0.472 9＞0.05，说明回归方程与试验拟合良好，误差小。回归方程中一次项A、D为显著因素，二次项中4 个因素（A2、B2、C2、D2）均表现出极显著性，交互项中AC、AD存在显著性，其余各项对黑豆花青素提取率影响均不显著。依据表中F值的大小，可知考察因素对黑豆花青素提取率的影响顺序依次为B＞D＞C＞A。综上分析，表明该模型可真实地反映出考察因素对提取率影响，可用此模型对黑豆花青素提取工艺进行优化及预测。

表3 回归模型分析Table 3 Regression model analysis

2.2.2 响应面交互作用分析

响应面图描述因素与响应值之间关系的三维空间曲面图，可直观呈现各因素之间的交互作用对黑豆花青素提取率的影响程度[17]。图5、图6列出的是对黑豆花青素提取率有显著交互作用的响应面和等高线图。图5显示的是乙醇浓度A和处理压力C之间的交互关系，在其他因素不变的前提下，曲面的陡峭程度越大，等高线的线圈越密集，表明两个因素之间的交互作用越强，对响应值影响也越大。由响应面图可知，处理压力和乙醇浓度的编码值在[0-1]之间，相应值变化幅度较大，且由最高点。

图6显示，乙醇浓度A和保压时间D之间的交互作用，乙醇浓度和保压时间的编码之在[0-1]之间，随着乙醇浓度和保压时间的增加，黑豆花青素的提取率也增加，但超出此范围内，两者交互作用减弱，提取率随着两者的增加而减小。

图5 乙醇浓度和处理压力交互作用的等高线及响应面图Fig.5 Contour and response surface diagram of the interaction between ethanol concentration and treatment pressure

图6 乙醇浓度和保压时间交互作用的等高线及响应面图Fig.6 Contour and response surface diagram of the interaction between ethanol concentration and holding time

2.2.3 最佳工艺条件的确定及验证实验

通过Design-Expert8.0.5.0软件对回归模型预测及优化分析，得出超高压辅助提取黑豆花青素的最佳工艺参数为乙醇浓度 70.10%、料液比 1∶41.40（g∶mL）、处理压力438 MPa、和保压时间6.12 min，在此参数下，超高压辅助提取黑豆花青素的提取率预测值为3.36 mg·g-1。

通过回归模型预测得到的黑豆花青素含量是一个理论值，为了验证理论值是否能反映实际值，开展验证实验。考虑到试验的实际可操作性，将最佳工艺参数修正为乙醇浓度 70%、料液比 1∶40（g∶mL）、处理压力438 MPa和保压时间6 min。为保证验证试验结果的准确性，试验次数设定为3次，其提取率平均值为3.47 mg·g-1，与预测值相比，相对误差值不超过10%，表明黑豆花青素在优化后的得率与最大得率的预测值很接近。说明模型可靠，回归方程可以反映各因素对花青素提取率的影响。

3 结论与讨论

研究结果表明，超高压辅助提取黑豆花青素的最佳工艺为乙醇浓度 70%、料液比 1∶40（g∶mL）、处理压力438 MPa和保压时间6 min。在此条件下，黑豆花青素的提取率为3.47 mg·g-1。与模型预测值相比，相对误差值仅为0.03%，证明该模型是可靠的，可用于实际生产。

超高压提取给原料施加了强大的压力，促使溶剂快速地渗透到固体原料内部，这样原料中有效成分就会溶解在溶剂中，具有省时、绿色、方便、提取效果好等优点[18]。据研究证实，超高压虽能破坏分子间氢键、离子键等非共价键，但对共价键影响不大。因此，采用超高压提取活性成分，生物大分子类物质受其影响可能会发生变性，但小分子物质如黄酮、生物碱、色素等受其影响不大[19-20]。说明超高压技术提取花青素类物质不仅提取率高，且能保持花青素的活性成分，为食品中有效成分的提取提供了新技术、新方法。虽然超高压提取存在诸多优势，但应用研究仍处于起步阶段，未来需深入研究超高压技术对蛋白质变性、分子结构和酶活性等方面的影响，为超高压技术的广泛应用奠定基础。