鸭体内一种绦虫的分子生物学鉴定

2020-11-06张弘弢李春林陈媛媛常巧呈

黑龙江八一农垦大学学报 2020年5期

张弘弢，李春林，陈媛媛，常巧呈

（黑龙江八一农垦大学动科科技学院，大庆 163319）

家畜绦虫的病原体属于扁形动物门中的一种绦虫纲，其中只有假叶目与圆叶目的绦虫对人和家养动物具有感染性，感染绦虫的人或者动物都会出现严重的疾病[1]。绦虫虫体的主要形态包括扁平形、分节形以及带状形，虫体体长大小不等，一般在毫米到数十厘米的之间。绦虫的虫体共有头节、颈节和体节3个部分。头节一般比较细小同时又附着器官，根据器官又可分为三类：包括吸盘型、吸叶型和吸槽型。颈节位于头节的后部，是生长体节的部位，比头节要细一些，不会分节[2]。由节片组成的链体构成体节，体节的数目决定绦虫的大小，随着体节的增多，绦虫的虫体会增大。生殖器官存在于各个节片，尾部节片内的生殖器官会慢慢的萎缩，但其尾节的子宫会存在大量虫卵，因而尾节又被称为孕卵节片[3]。为保持虫体大小不变，在虫体末端的孕卵节片会逐渐地从虫体上脱落的同时，新节片也会不断从颈节后部长出。我国致使鸭绦虫病的主要绦虫包括矛形剑带绦虫、片形皱褶绦虫和美丽膜壳绦虫等[4]。片形皱褶绦虫（Fimbriaria fasiolaris）为膜壳属大中型绦虫，真头节较小，易脱落，长度为200.0～400.0 mm，宽 2.0～5.0 mm，其头节上有吸盘，吻突上有小钩，头节后有一个附着器（成扫帚状很大的皱褶假头），大小有 1.9～6.0 mm×1.5 mm[5]。在其体内有3个睾丸，呈椭圆形。网状分布的卵巢被连接在全部成熟的孕节片内，其子宫呈短管状且遍布虫卵，虫卵大小为131.0×74.0μm，呈椭圆形，虫卵两端都呈尖状，虫卵外模呈薄而透明状。

鸭片形皱褶绦虫在世界范围内广泛分布，主要附生在雁形目鸟类的小肠中。且大多为散发性的，偶尔为地方性流行。片形皱褶绦虫在感染鸭类宿主时是需要中间宿主参与的，中间宿主主要为挠足类，有普通镖水蚤（Diaptomus vulgaris）和剑水蚤等[6]。在中间挠足类宿主体内经过18～20 d，鸭片形皱褶绦虫虫卵在8～14℃条件下发育为成熟的拟囊尾蚴，然后鸭类等动物在进食过程中吞食了含有片形皱褶绦虫成熟拟囊尾蚴的挠足类昆虫，经过16 d后再鸭类体内的片形皱褶绦虫成熟拟囊尾蚴就会发育成成虫，从而使鸭感染上片形皱褶绦虫。片形皱褶绦虫主要附生在鸭类动物的小肠中，致使患禽肠壁上形成结节样病变，鸭类动物发生消化障碍，开始导致鸭类出现消化不良、缺乏营养和生长缓慢等问题，同时存在于鸭体内的片形皱褶绦虫还会分泌一种神经毒素，加重鸭类的病情，严重的情况还会导致鸭群产生严重的肠炎、腹泻、贫血和黄疸，大量的片形皱褶绦虫在小肠内聚集从而导致小肠出现堵塞或者穿孔，最终导致死亡。病鸭显著的症状为食欲不佳、生长缓慢和发育阻滞并伴随着贫血、黄疸以及腹泻，剖检的病鸭小肠内可见大量附生的片形皱褶绦虫，引发小肠产生炎症，严重时还会造成小肠穿孔或者堵塞小肠。片形皱褶绦虫能侵染不同年岁的鸭，但17日龄以后的雏鸭对片形皱褶绦虫抵抗能力最弱，雏鸭也因此在25～40日龄丧生，导致养殖户损失严重，这也是我国大部分养鸭养殖户很头疼问题[7]。

为了解决养殖户们遇到的困难，减少他们的经济损失，研究选择了黑龙江省大庆市大同区成年鸭体内的鸭绦虫进行采集。目的是辨别鸭体内绦虫的类别，以便能更有针对性的治疗鸭绦虫病，绦虫选取后进行清洗，并保存在70%的酒精中带回进行实验室检测[8]。由于虫体较长且上半身纤瘦，易成簇状，在拆解时由于头节的细小和操作不当而无法获得完整的头节，头节又是形态学鉴别虫体的重要依据，故该虫体无法选用染色、装片的形态学鉴定[9]，所以在接收该虫体后决定以虫体DNA为模板，分别以核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区（ITS）和线粒体DNA（mtDNA）中细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基（cox1）的部分基因（pcox1）作为遗传标记对虫体进行PCR扩增及序列分析，进而确定虫体种类[10]。通过实验对鸭绦虫的分子生物学测序，为片形皱褶绦虫虫体的鉴定和对病鸭是否感染片形皱褶绦虫提供参考依据[11-15]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 寄生虫来源

鸭绦虫采集于黑龙江省大庆市大同区成年鸭体内。

1.1.2 实验试剂

Ex Taq DNA 聚合酶、Ex Taq Buffer、DNA Marker（2 000）、DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）、超净水、引物、核酸电泳缓冲液（TAE）、6×Loading Buffer、琼脂糖（AGAROSE G-10）、dNTP Mixture、溴化乙锭（EB）。

1.1.3 主要仪器

LX-100手掌型离心机（江苏海林市其林贝尔仪器制造有限公司）；2-16PK型高速台式离心机（SIGMA公司）；PCR 仪（TaKaRa）；YP202N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；微波炉（青岛海尔制品有限公司）电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；Hws24电热恒温水浴锅（上海一恒仪器有限公司）Gel Doc 2 000紫外凝胶成像分析系统（美国Bio-RAD）。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA的提取

具体步骤如下：

（1）取虫体，将虫体用去离子水多次冲刷（3～5次，每次吸5下）。

（2）放入1.5 mL离心管，加200μL缓冲液GA和20μL蛋白酶K，56℃水浴消化3～4 h。

（3）向离心管中加入200μL缓冲液GB混匀，放入70℃水浴锅10 min，再置于4℃冰箱3 min，取出瞬离除壁上水珠。

（4）取出后加200μL无水乙醇，震动15 s，瞬离。

（5）所得溶液放入血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的吸附柱CB3内，讲吸附柱放入收集管中。颠倒混匀，放入高速离心机中12 000 rad·min-1离心30 s，倒废液，重新安置到吸附柱上。

（6）在吸附柱CB3内加入500μL缓冲液GD，12 000 rad·min-1离心 30 s，倒废液，重新安置到吸附柱上。

（7）在吸附柱CB3内加入700μL漂洗液PW，12 000 rad·min-1离心 30 s，倒废液，重新安置到吸附柱上[14]。

（8）重复步骤七，但是所用漂洗液PW改为500μL。

（9）12 000 rad·min-1空离 2 min，倒废液，将吸附柱安置到离心管，室温静置3 min。

（10）将吸附柱CB3放于一个干净的离心管，加入100μL洗脱缓冲液TE，注意加在吸附柱CB3的白色膜上，但不要戳破白色膜。室温放置2～5 min；再放入高速离心机，12 000 rad·min-1离心2 min；重复上述步骤一次，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。

1.2.2 目的基因的扩增

以pcox1作为目的基因的引物为通用引物由Gasser等[16]设计。上游引物：5’-ATGATH TTYTTYTTYTTRATGCC-3’；下游引物：5’-ACAWCHARHCCHACHGTRAACAT-3’。

以ITS作为目的基因的引物为通用引物由Gasser等[14]设计。上游引物：5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’；下游引物：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’表1为PCR反应体系。

表1 PCR反应体系Table 1 PCR reaction system

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳

（1）根据试验样本数量，选择小板小孔。

（2）称取0.2 g AGAROSEG-10（琼脂糖），20 mL 1×TAE。

（3）为使混合物完全溶解，先使用微波炉进行加热，在自然散热，降温至不烫手，点溴化乙锭并摇匀，倒入提前放置好的板中，静止约25 min。大约在PCR结束时就可直接进行下一步。

（4）将凝胶拿出，放入电泳槽，注意放在规定位置。

（5）取出所需加入板内的模板、6×Loading Buffer（保存在4℃冰箱中）、PL 2 000 Maker。取塑料纸片，将取出的Loading Buffer根据样本数量分别点3μL在纸上。再分别用适量的DNA模板与Loading Buffer混匀，吸取，加入凝胶孔中。Maker加在左侧，大约3μL。注意加样时不要把凝胶戳破。

（6）加样完毕后，盖上电泳槽，电压设置120 V，电流设置140 mA，开始运行。

（7）在加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源，取出凝胶，使用凝胶成像系统观察结果。

1.2.4 PCR产物送检测序

将鉴定为阳性的PCR产物冰冻，委托上海生工生物工程公司测序。

1.2.5 目标基因ITS序列比较分析

研究中对的线虫进行同源性分析软件为MegAlign软件。

1.2.6 进化分析

（1）从GenBank上选取一种线虫作为外群，对膜壳科的6种绦虫和戴维科的3种绦虫共11种绦虫的相关基因，应用MEGA软件构建研究中虫体pcox1进化树，鉴定其所属关系。

（2）从GenBank上选取柯氏伪裸头绦虫作为外群，对膜壳科不同属绦虫共6种绦虫的相关基因，应用MEGA软件构建研究中虫体ITS进化树，鉴定其所属关。

2 结果

2.1 pcox1基因的扩增

电泳结果可见下图1，分析可知对实验中虫体pcox1进行扩增后，可在约700 bp处见明显的单一条带。

图1 pcox1基因PCR结果Fig.1 Pcox1 gene PCR results

2.2 ITS基因的扩增

电泳结果可见下图2，分析可知对实验中虫体ITS进行扩增后，可在约1 400 bp处见明显的单一条带。

2.3 目的基因pcox1的测序结果

测序结果显示，研究虫体中pcox1序列大小为698 bp（见图 3）。

图3 虫体pcox1基因扩增物序列Fig.3 Pcox1 gene amplicon sequence of the insect

图2 ITS基因PCR结果Fig.2 ITSgene PCR results

2.4 目的基因ITS的测序结果

测序结果显示，研究中虫体ITS序列大小为1 449 bp（见图 4）。

图4 虫体ITS基因扩增物序列Fig.4 ITSgene amplicon sequence of the insect

2.5 pcox1序列比较分析

通过与Genbank公布的片形属未定种绦虫进行pcox1序列相比较，同源性为92.2%，结果如图5。

图5 pcox1基因同源性分析Fig.5 Homology analysis of pcox1 gene

2.6 ITS序列比较分析

通过与Genbank公布的片形属片形褶皱绦虫进行ITS序列相比较，同源性为99.3%，结果如图6。

图6 ITS基因同源性分析Fig.6 Homology analysis of ITSgene

2.7 pcox1序列进化分析

以一种线虫为外群，对膜壳科和戴维科绦虫进行建树，结果如图7。由图可以看出实验绦虫与片形属绦虫位于同一分支。

图7 基因pcox1序列对研究虫体进行进化性分析Fig.7 Pcox1 sequence was used to analyze the evolution of the insect

2.8 ITS序列进化分析

以一种拟囊绦虫为外群，对膜壳科不同属的绦虫进行建树，结果如图8。由图可以看出实验绦虫与片形褶皱绦虫位于同一分支。

图8 基因ITS序列对研究虫体进行进化性分析Fig.8 The ITSsequence was used to analyze the evolution of the insect

3 讨论

3.1 目的基因选取的讨论

目前用于构建系统发育树的基因，以线粒体pcox1和核糖体ITS1、ITS2基因应用最为广泛。其中，在使用pcox1基因作为分子标记时范围没有核糖体ITS1、ITS2基因那么广。pcox1和ITS都拥有高度的保守性，但pcox1基因的特点为种内分化弱，种间分化强，而rDNA序列功能上具有进化时钟性，目前已经被应用到物种分类与进化分析中，尤其是种间的分类[17-18]。ITS进化快，物种内发生变异的几率小，物种间发生变异的几率大[19]。通过分析ITS序列可以构建进化树并分析其亲缘关系。但是实验由于基因库中没有片形褶皱绦虫的pcox1基因，所以用pcox1作为目的基因只鉴定了该未知虫体的属，而无法确定鉴定该绦虫具体是什么，而基因库中有片形褶皱绦虫ITS的序列，所以我们可以确切的证明未知绦虫为片形褶皱绦虫。理论上种属的鉴定ITS比较可靠，但是因为条件不同所以在试验中无法说明到底哪种目的基因好。因此完善的基因库对于鉴别虫体就显的至关重要，同时这也是分子生物学鉴定方法发展至今的一个亟待解决的问题，需要科研工作者积极研究、共享。

3.2 鉴定方法的讨论

对寄生虫进行分类和鉴定是进行此类研究的基础。因此形态学鉴定与分子生物学鉴定收到大家的青睐，被广泛使用[20]。

第一，形态学在寄生虫鉴定非常直观，没有太多的步骤；只要虫体保存完整，人们可以进行若干次的重复观察，还可以与标准模板比对，进一步减少误差。第二，形态学鉴定方便，无需大量仪器，易操作；部分寄生虫形态特征明显，对于这类寄生虫，形态学鉴定是最便捷的措施。第三，形态学鉴定无需花费大量时间，如果是具有明显形态学特征的寄生虫，经验丰富的鉴定人员可以在最短的时间内鉴定出结果；而分子生物学鉴定需要几天时间才能完成。与此同时，形态学鉴定也有不足的地方。对于一些形态差异很小的近缘种或者近似物种，很难利用形态学进行准确鉴定，对于经验不够丰富者而言就更加困难。而如果虫体经过运输等原因，保存不当，导致虫体被破坏，就更加难以利用形态学鉴定。

对于难以利用形态学鉴定的虫体，分子生物学鉴定的优势就凸显出来。分子生物学能够识别和鉴定形态上非常相似的不同亚种、生物型、地理种群[21]。但高新技术在使用过程中也总是伴随着各种不足。比如仪器紧密程度，每一个环节中所使用的化学试剂与生物制剂的质量，实验环境的分子污染问题等都能影响。并且分子生物学鉴定的研究历史不长，积累的基因库资料不够丰富也可能会导致无法对需要鉴定的寄生虫准确鉴定。

研究中由于获得寄生虫虫体保存不当，不利于进行形态学鉴定。为确定虫体种类，选择以虫体DNA为模板，以核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区（ITS）及线粒体DNA（mtDNA）中细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基（cox1）分别作为遗传标记，对虫体进行PCR扩增及序列分析[22]。

3.3 预防鸭绦虫病的讨论

成年携带鸭绦虫病的鸭类是致使鸭绦虫病传播的主要传染源，绦虫的虫卵会潜藏在成年鸭的排泄物中，随着粪便的排出流出体外。与此同时，剑水蚤作为中间宿主会趁机夹带粪便内的绦虫虫卵，帮助绦虫虫卵在水中大面积的扩散传播。当遇见其它成年鸭或番鸭时，剑水蚤会侵染它们，致使其它鸭也患上绦虫病。为了防止鸭绦虫病的流行，减少养殖户们的损失，依据鸭绦虫病的传播方式和流行特点，以及中间宿主剑水蚤的活动方式，对预防鸭绦虫病提出了以下几点建议，第一，应选择在冬天和春天刚刚来临的时候，对成年鸭群进行全面驱虫，此时的中间宿主剑水蚤已大部分死亡，这样可以杜绝中间宿主与成年鸭的接触，阻碍剑水蚤携带绦虫，将剑水蚤的危害降到最小，驱虫后的粪便也应及时处理，保证清洁的卫生环境。第二，对于鸭绦虫病流行地区的雏鸭，应当合理的做好规划，定期的对雏鸭群进行驱虫处理，并且在驱虫后的21 h内及时清扫粪便并堆积发酵，以防止寄生虫的四散传播。日常也要保证雏鸭居住环境的卫生条件，做到粪便及时清理，并且做好防范，避免外来因素造成污染。第三，对于鸭绦虫病流行区域的成年鸭和番鸭，要将两者分开饲养，保持在合理的安全间隔。条件允许的情况下，尽量在不同的区域居住和放牧，阻断番鸭和成年鸭接触的可能性，避免番鸭受到成年鸭的感染。第四，鸭绦虫流行区域的饲养场，建议不同区域的鸭群实行配备单独的饮食装置和饮水装置，防止不同区域的装置混淆，造成交叉感染。工作人员也应及时清洁饮食装置和饮水装置的卫生，避免寄生虫卵的残留，造成病从口入。第五，在选择放牧的区域时，应尽量选择深水的区域或水源可流动的区域进行放牧，这样可以减少单位面积内剑水蚤的数量，降低鸭群接触到剑水蚤的几率。第六，以鸭的体重作为依据，在饲料和饮水中定量的加入丙硫苯咪唑。丙硫苯咪作为一种新型的广谱的驱虫药，对鸭绦虫病有着很好的预防效果，且具有毒性值很小、作用范围广的特性，除绦虫外，对其他的寄生虫也有着很好的祛除效果，有着很高的性价比，是养殖户们节约成本的一种较优选择。