miR-486靶向DOCK3对肺间质纤维化的影响

张 娜,石雪峰

(青海省人民医院呼吸科,青海 810000)

肺间质纤维化是一种呼吸系统常见的慢性进展性肺部疾病,细胞外基质过度沉积、肺间质成纤维细胞广泛增殖、肺泡上皮细胞损伤和肺组织结构异常重塑等是其重要的病理特征[1-3]。临床上,多以抗炎和激素类药物来缓解病情,目前尚无根治的方法[4]。大量研究显示,在肺间质纤维化过程中存在异常表达的微小RNA(microRNA,miRNA),而这些miRNAs可能通过调控相关靶基因影响肺成纤维细胞上皮间质转化,起到促进或抑制纤维化的作用[5,6]。近年来,有研究证实,miR-486具有抑制肺间质纤维化的作用[4],但其作用机制并不完全清楚。胞质分裂作用因子3(dedicator of cytokinesis 3,DOCK3)是鸟嘌呤核苷酸交换因子家族成员,可通过激活小G蛋白影响下游相关信号通路,在细胞骨架重组方面发挥着重要作用,与肺纤维化、癫痫和肿瘤等疾病的发生发展密切相关[7-9]。本研究开展前期采用TargetScanHuman生物信息学软件预测到miR-486与DOCK3 3′非编码区(untranslated region,UTR)存在互补的结合位点,故猜测miR-486可能通过靶向调控DOCK3表达参与肺间质纤维化发病过程;为此,本研究以体外培养的正常人肺成纤维细胞为基础,探讨miR-486是否通过靶向调控DOCK3在肺间质纤维化中发挥抗纤维化作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人肺成纤维细胞系NHLF(北京泽平科技有限责任公司),高糖DMEM培养基、胎牛血清、Trizol、脂质体2000、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),pGL3-basic荧光素酶报告载体(上海海吉浩格生物科技有限公司),miR-486模拟物(上海吉玛制药技术有限公司),DOCK3过表达载体质粒(上海汉恒生物科技有限公司),兔抗人DOCK3多克隆抗体和重组人转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(北京百奥莱博科技有限公司)、兔抗人I型胶原蛋白(collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)、E钙黏附蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)多克隆抗体和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(英国Abcam公司)。

1.2 细胞分组与处理

采用含10%胎牛血清高糖DMEM培养基(完全培养基)在5% CO2、饱和湿度的37 ℃常规培养NHLF细胞。以完全培养基培养的细胞作为对照组,以含10 ng/ml TGF-β1的完全培养基培养的细胞作为诱导组[10],将miR-486模拟物及其阴性对照转染至细胞后以含10 ng/ml TGF-β1完全培养基培养的细胞作为诱导+miR-486组和诱导+miR-NC组,将miR-486模拟物与空载体质粒及DOCK3过表达载体质粒共转染至细胞后以含10 ng/ml TGF-β1完全培养基培养的细胞作为诱导+miR-486+vector组和诱导+miR-486+DOCK3组,每组设置3个重复。将对数生长期的肺成纤维细胞接种至6孔板,常规培养至70%-80%融合度时,按照实验分组参照脂质体2000说明书步骤将miR-486模拟物、DOCK3过表达载体质粒以及相应的对照转染至细胞中。转染5 h,换新鲜培养液,继续培养48 h。

1.3 双荧光素酶报告基因实验

采用TargetScanHuman生物信息学软件预测到miR-486和DOCK3 3′UTR之间存在互补的结合位点。将含miR-486和DOCK3 3′UTR结合位点的片段序列克隆重组至荧光素酶报告基因载体,以构建DOCK3野生型载体质粒(DOCK3-WT);而将miR-486和DOCK3 3′UTR结合位点突变后的片段序列克隆重组至荧光素酶报告基因载体上来构建DOCK3突变型载体质粒(DOCK3-MUT)。参照脂质体2000说明书将构建的载体质粒分别与miR-486模拟物及其阴性对照共转染至H9C2细胞中,转染48 h后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测细胞的荧光素酶活性。实验重复3次。

1.4 实时荧光定量PCR检测miR-486表达水平

收集处理结束后的对照组、诱导组、诱导+miR-NC组和诱导+miR-486组细胞,加入Trizol试剂提取细胞总RNA后,将RNA逆转录合成cDNA。以cDNA为模板,根据锐博生物合成的引物上荧光定量PCR仪扩增。以U6为管家基因,采用2-ΔΔCt法检测细胞中miR-486表达水平。实验重复3次。其中,miR-486上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.5 免疫印迹法检测DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平

收集处理结束后的各组细胞,加入细胞裂解液抽提细胞总蛋白后,采用考马斯亮蓝法定量蛋白浓度。将变性后的蛋白样品行电泳分离后,转膜;5%脱脂奶粉封闭后,以DOCK3(1 ∶500)、collagen Ⅰ(1 ∶1 000)、collagen Ⅲ(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶500)、α-SMA(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶800)和β-actin(1 ∶1 000)抗体4 ℃孵育过夜;经辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h,电化学发光法显影曝光;以β-actin为内参,采用凝胶成像分析系统扫描分析细胞中目的蛋白表达水平。实验重复3次。

1.6 统计学分析

采用SPSS 24.0进行统计学分析。计量资料以平均数±标准差表示,两组比较行t检验;多组间比较行单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验;P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-486和DOCK3靶向关系的验证结果

TargetScanHuman生物信息学软件预测结果显示,miR-486和DOCK3 3′UTR之间存在互补的结合位点(见图1)。与miR-NC+DOCK3-WT比较,miR-486+DOCK3-WT共转染细胞荧光素酶活性明显降低(0.34±0.03vs0.98±0.05,t=32.928,P<0.05);但miR-NC+DOCK3-MUT和miR-486+DOCK3-MUT共转染细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义(0.95±0.06vs1.01±0.08,t=1.800,P=0.090 7>0.05)。

图1 TargetScan软件预测miR-486和DOCK3 3′UTR之间存在互补的结合位点Figure 1 Complementary binding sites between miR-486 and DOCK3 3′UTR predicted by Targetscan software

2.2 转染miR-486模拟物对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞中miR-486和DOCK3表达的影响

与对照组比较,诱导组细胞中miR-486表达水平明显降低,而DOCK3蛋白表达水平明显升高(P<0.05);然而,miR-NC组和诱导组之间miR-486和DOCK3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与诱导+miR-NC组比较,诱导+miR-486组细胞中miR-486表达水平明显升高,而DOCK3蛋白表达水平明显降低(P<0.05,见图2和表1)。

图2 免疫印迹法检测DOCK3蛋白表达Figure 2 The expression of DOCK3 protein by Western blot

表1 各组细胞中miR-486和DOCK3蛋白表达水平比较

2.3 miR-486过表达对肺成纤维细胞胶原蛋白表达的影响

对照组、诱导组、诱导+miR-NC组和诱导+miR-486组细胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=349.177,223.119,均P<0.05)。与对照组比较,诱导组细胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与诱导组比较,诱导+miR-NC组细胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与诱导+miR-NC组比较,诱导+miR-486组细胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表达水平明显降低(P<0.05,见图3)。

与对照组比较,*P<0.05;与诱导+miR-NC组比较,#P<0.05图3 miR-486过表达对肺成纤维细胞胶原蛋白表达的影响Figure 3 Effect of miR-486 overexpression on collagen expression in lung fibroblasts

2.4 miR-486过表达对肺成纤维细胞上皮间质转化的影响

对照组、诱导组、诱导+miR-NC组和诱导+miR-486组细胞中E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=175.258,84.245,223.175,P均<0.05)。与对照组比较,诱导组细胞中上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平明显降低,而间质标志物α-SMA和vimentin蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与诱导组比较,诱导+miR-NC组细胞E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);但诱导+miR-486组细胞中E-cadherin蛋白表达水平较诱导+miR-NC组明显升高,而α-SMA和vimentin蛋白表达水平较诱导+miR-NC组明显降低(P<0.05,见图4)。

与对照组比较,*P<0.05;与诱导+miR-NC组比较,#P<0.05图4 miR-486过表达对肺成纤维细胞上皮间质转化的影响Figure 4 Effect of miR-486 overexpression on epithelial mesenchymal transition of lung fibroblasts

2.5 上调DOCK3表达对miR-486过表达的肺成纤维细胞胶原蛋白和上皮间质转化的影响

诱导+miR-486组、诱导+miR-486+vector组和诱导+miR-486+DOCK3组细胞中DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=465.500,35.206,140.824,106.676,248.029,47.634,均P<0.05)。与诱导+miR-486组比较,诱导+miR-486+vector组细胞中DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05);与诱导+miR-486+vector组比较,诱导+miR-486+DOCK3组细胞中DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA和vimentin蛋白表达水平均明显升高,而E-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.05,见图5)。

与诱导+miR-486+vector组比较,*P<0.05图5 上调DOCK3表达对miR-486过表达的肺成纤维细胞胶原蛋白和上皮间质转化的影响Figure 5 Effects of up-regulating DOCK3 expression on collagen and epithelial mesenchymal transition of miR-486-overexpressed lung fibroblasts

3 讨论

上皮间质转化是上皮细胞丧失原有极性转化为有侵袭和迁移能力的间质细胞的生理过程,而肺泡上皮间质转化可促进成纤维母细胞灶的形成,引起胶原蛋白和纤维蛋白等细胞外基质蛋白过分沉积,加重肺泡结构损伤,最终导致肺间质纤维化[5,11]。TGF-β1是肺间质纤维化发病过程中重要的炎性因子,可通过调控SMADS蛋白信号转导介导上皮间质转化促进胶原collagen Ⅰ和collagen Ⅲ等细胞外基质过度沉积,被认为是重要的致纤维化因子[12-14]。本研究以10 ng/ml TGF-β1刺激人肺成纤维细胞后,胶原蛋白collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和间质标志物α-SMA、vimentin蛋白表达明显升高,而上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平明显降低。结果表明,TGF-β1可通过介导上皮间质转化导致胶原合成增加,细胞外基质过度沉积,肺纤维化细胞模型构建成功。

miRNAs是一类内源性非编码RNA,可通过与靶基因3′UTR碱基互补配对结合调控其表达,在细胞增殖、分化和上皮间质转化等过程中发挥着重要作用,与包括肺纤维化在内的多种组织器官纤维化疾病的发生密切相关[15-18]。本研究结果显示,TGF-β1可使肺成纤维细胞中miR-486表达水平明显降低,而miR-486过表达可通过下调α-SMA蛋白表达;该结果与Ji等[19]研究所得到的miR-486可通过抑制SMAD2表达下调细胞外基质组分纤黏蛋白和α-SMA蛋白表达抑制成纤维细胞增殖与分泌而发挥抗纤维化作用的结果相吻合。此外,本研究结果显示,miR-486过表达可明显抑制TGF-β1对成纤维细胞中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、vimentin、E-cadherin蛋白表达的调控作用。结果表明,miR-486过表达可通过减弱胶原合成和上皮间质转化进程抑制TGF-β1诱导的肺纤维化。

DOCK3是鸟嘌呤核苷酸交换因子家族成员,不仅可通过调控肿瘤细胞侵袭和迁移促进非小细胞肺癌的发生发展[20],还在肺纤维化患者中异常高表达,与肺间质纤维化发病密切相关[9]。本研究采用TargetScanHuman生物信息学软件预测结果显示,miR-486与DOCK3 3′UTR端存在互补的结合位点;双荧光素酶报告基因实验证实miR-486可与DOCK3靶向结合;此外,TGF-β1刺激可使成纤维细胞中DOCK3蛋白表达水平明显升高,而miR-486过表达可抑制TGF-β1对DOCK3蛋白表达的促进作用。结果表明,DOCK3是miR-486的潜在靶基因,miR-486可负向调控DOCK3蛋白表达。该结果提示,miR-486靶向调控DOCK3可能是其抗纤维化的重要机制。通过转染DOCK3过表达载体成功上调DOCK3表达后,DOCK3可通过促进collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin和抑制E-cadherin蛋白表达促进miR-486过表达的肺成纤维细胞胶原蛋白合成和上皮间质转化。结果表明,DOCK3过表达可促进成纤维化细胞上皮间质转化。提示,在肺间质纤维化过程中,DOCK3可通过介导上皮间质转化促进纤维化,而miR-486可通过靶向下调其表达发挥抗纤维化作用。

综上所述,DOCK3是miR-486的潜在靶基因,miR-486可通过靶向调控其表达抑制肺成纤维细胞上皮间质转化,进而起到抗肺间质纤维化的作用。该结果在细胞水平上初步揭示了miR-486抗纤维化机制与其靶向调控DOCK3表达有关,但缺乏体内实验依据,后期将通过体内实验进一步验证,以期为miR-486用于肺纤维化的靶向治疗提供参考依据。