二甲双胍联合奥沙利铂对结肠癌SW480细胞凋亡及细胞周期的影响

陈玉忠,魏 丽,杜 军,韩冰清,石 磊,李 雷,马家驰*

(1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科,蚌埠 233000;2蚌埠医学院第一附属医院肿瘤妇科;3蚌埠医学院外科教研室;4宿州市第一人民医院外科;*通讯作者,E-mail:tsmjc2013@163.com)

由于生活方式及饮食结构的变化,结直肠癌已成为世界第三大恶性肿瘤[1]。另外,一部分病人在肿瘤确诊时已处于进展期,研究显示进展期病人具有较低的5年生存率(25%-39%)和高复发风险等特点[2]。结直肠癌的预防和治疗形势严峻。结直肠癌的治疗包括手术、放疗、化疗相结合的综合治疗[3]。奥沙利铂(oxaliplatin,Oxa)作为进展期结肠癌化疗的一线用药,能够有效地抑制结肠癌的恶性进展[4,5]。然而在化疗过程中肿瘤耐药的发生限制了奥沙利铂抗肿瘤作用[6]。奥沙利铂在抗肿瘤的同时,也会加剧癌性恶液质的进程[7]。因此,我们希望寻求一种较低毒性并能增加奥沙利铂在结直肠癌中化疗效应的药物。一项回顾性研究首次发现服用二甲双胍的2型糖尿病患者肿瘤的患病风险低,其潜在的抗肿瘤作用得到广泛关注,研究人员对二甲双胍抗肿瘤机制进行了探讨,其中二甲双胍与结直肠肿瘤的关系受到极大重视[8],Demb等[9]发现,二甲双胍可以降低结直肠肿瘤的发病率。本研究旨在探索二甲双胍联合奥沙利铂对结肠癌细胞SW480的抗肿瘤作用及与细胞周期相关机制,以期为结肠癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人结肠癌SW480细胞购于中国科学院上海细胞库。二甲双胍、奥沙利铂、MTT购于Sigma公司,二甲亚砜(DMSO)(Biosharp公司),DMEM培养基粉末、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司),溴化丙啶(propidium iodide,PI)购于中国Biotechnology公司。抗CDK4、Cyclin D1、P21、caspase-3及Bcl-2抗体购于中国Proteintech公司,兔抗二抗和β-actin购于美国Santa Cruz Biotechnology公司。

CO2培养箱(美国热电公司),酶标仪(Synergy HT公司,美国),流式细胞仪(BECTON DICKNSON公司,美国),光学显微镜(Leica公司,德国),倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司,日本)。凝胶成像系统(BIO-RAD公司,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SW480细胞在DMEM培养基(10%FBS、10 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)中培养,5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。

1.2.2 MTT法检测二甲双胍、奥沙利铂单独作用及两者联合应用后细胞存活率 SW480细胞以7 000/孔接种于96孔板中放入培养箱进行培养,每组6个复孔。培养24 h分别加入二甲双胍(0,5,10,20,40 mmol/L)、奥沙利铂(0,5,10,20,40 μmol/L)及10 mmol/L二甲双胍与10 μmol/L奥沙利铂混合物,培养箱中继续培养。分别于药物作用24 h加入15 μl MTT(5 mg/ml溶于PBS中),放入培养箱孵育4 h,将96孔板内液体吸出并加入200 μl DMSO,用酶标仪检测490 nm处每孔的吸光度OD值,并用公式计算细胞的存活率(%):存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白OD值)×100%。

1.2.3 PI单染法检测二甲双胍、奥沙利铂单独作用及两者联合应用后细胞凋亡 接种细胞1.4×105/孔于12孔板中,放入培养箱培养24 h,分别加入二甲双胍(0,5,10,20,40 mmol/L)、奥沙利铂(0,5,10,20,40 μmol/L)及10 mmol/L二甲双胍与10 μmol/L奥沙利铂混合物,继续培养24 h,收取细胞行PI染色用流式细胞仪检测。

1.2.4 流式细胞术检测二甲双胍、奥沙利铂及两者联合应用后细胞周期的变化 在6孔板中接种SW480细胞,每孔2×105个细胞,培养箱中孵育24 h。分别加入10 mmol/L二甲双胍、10 μmol/L奥沙利铂及两者联合继续孵育24 h。收集细胞加入70%乙醇固定2 h。收取细胞进行PI染色用流式细胞仪检测细胞周期情况。

1.2.5 Western blot法检测二甲双胍、奥沙利铂及两者联合作用后细胞凋亡及细胞周期相关蛋白表达 应用二甲双胍、奥沙利铂及10 mmol/L二甲双胍与10 μmol/L奥沙利铂联合处理SW480细胞24 h,收取细胞,用RIPA蛋白裂解缓冲液冰上裂解样本30 min,放入4 ℃离心机12 000 r/min离心30 min,提取样本的上清液进行蛋白定量,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿转法将蛋白条带转至PVDF膜,进行蛋白封闭,洗膜后分别孵育一抗(抗体稀释浓度为:抗CDK4抗体为1 ∶1 000,抗Cyclin D1抗体为1 ∶500-1 ∶1 000,抗P21抗体为1 ∶500-1 ∶1 000,抗caspase-3抗体为1 ∶500,抗Bcl-2抗体为1 ∶1 000,抗β-actin抗体为1 ∶1 000)、二抗(兔抗二抗稀释比例为1 ∶2 000)进行曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 二甲双胍、奥沙利铂及两者联合抑制SW480细胞的增殖

MTT法检测结果显示,二甲双胍(0,5,10,20,40 mmol/L)、奥沙利铂(0,5,10,20,40 μmol/L)作用SW480细胞株24 h后,SW480细胞的增殖明显被抑制,随着二甲双胍及奥沙利铂浓度的增加,细胞增殖抑制的作用增强(P<0.05,见图1)。为探索二甲双胍联合奥沙利铂的抗肿瘤效应,选取二甲双胍浓度10 mmol/L及奥沙利铂10 μmol/L进行联合用药实验。10 mmol/L二甲双胍联合10 μmol/L奥沙利铂作用SW480细胞24 h,与空白组及单独给药组相比,联合用药组可明显抑制细胞活力(P<0.05,见图1)。

与空白组相比,*P<0.05图1 MTT法检测Met和Oxa作用24 h对人结肠癌细胞SW480细胞增殖的影响Figure 1 Effect of Met and Oxa for 24 h on cell proliferation of human colon cancer cell line SW480 by MTT

2.2 二甲双胍、奥沙利铂及两者联合促进SW480细胞的凋亡

为探索二甲双胍、奥沙利铂对结肠癌SW480细胞的凋亡情况,分别应用二甲双胍(0,5,10,20,40 mmol/L)、奥沙利铂(0,5,10,20,40 μmol/L)作用SW480细胞株24 h,结果表明与空白组相比,细胞凋亡率随着给药浓度的增加而增加(见图2)。10 mmol/L二甲双胍、10 μmol/L奥沙利铂及两者联合分别作用SW480细胞24 h,与空白组及单独给药组相比,联合用药组结肠癌SW480细胞的凋亡明显增加(P<0.05,见图2)。

与未给药组相比，*P<0.05;与空白组及单药组相比，#P<0.05图2 Met和Oxa作用24 h对人结肠癌细胞SW480细胞凋亡率的影响Figure 2 The effect of Met and Oxa for 24 h on cell apoptosis rate of human colon cancer cell line SW480

2.3 二甲双胍和奥沙利铂联合应用对SW480细胞周期的影响

为探究二甲双胍及奥沙利铂对结肠癌SW480细胞周期的影响,10 mmol/L二甲双胍、10 μmol/L奥沙利铂及两者联合分别作用SW480细胞24 h。实验结果表明,与空白组、二甲双胍及奥沙利铂单独应用组相比,联合用药组SW480细胞在G0/G1期比例增加(P<0.05,见图3)。这表明二甲双胍联合奥沙利铂可将结肠癌细胞SW480细胞阻滞在G0/G1期。

与其他三组相比,*P<0.05图3 Met和Oxa对人结肠癌细胞SW480细胞周期的影响Figure 3 Effects of Met and Oxa on cell cycle of human colon cancer cell line SW480

2.4 二甲双胍及奥沙利铂对结肠癌SW480细胞凋亡及周期相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示,二甲双胍及奥沙利铂联合作用于SW480细胞后Cyclin D1及CDK4的表达降低,P21的表达增加,促凋亡蛋白cleaved-caspase-3表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低(见图4)。

与其他三组相比,*P<0.05图4 Met和Oxa对人结肠癌细胞SW480凋亡及细胞周期相关蛋白表达的影响Figure 4 Effects of metformin(10 mmol/L) and oxaliplatin(10 μmol/L) on the expression of apoptosis and cell cycle related proteins in human colon cancer cell line SW480

3 讨论

奥沙利铂作为一线抗肿瘤药物,已在结直肠癌及其他实体瘤的治疗中广泛应用[10],研究表明奥沙利铂通过与DNA结合干扰其损伤修复过程来发挥抗肿瘤作用,而治疗过程中肿瘤耐药的产生限制了其在化疗中的应用[10,11]。为增加奥沙利铂在结直肠癌中的抗肿瘤作用,目前常用的化疗方案通常会联合应用5-氟尿嘧啶。然而,化疗药物的联合应用常常会导致药物毒性增加,最终对机体造成严重损伤[12]。不同的化疗策略及联合用药[13]不断地在实践中摸索,以期对肿瘤病人的治疗能够在增加获益和减少毒性之间寻求平衡。

二甲双胍作为糖尿病治疗药物之一,越来越多地应用于肿瘤治疗中。临床试验数据表明,二甲双胍可改善应用奥沙利铂进行化疗的结直肠癌患者周围神经病变[14]。研究揭示,二甲双胍多种肿瘤的治疗中可促进化疗药物的疗效并减少化疗药物剂量及副作用。另外在应用中,二甲双胍通过口服给药即可以达到对化疗药物的增效作用[15,16]。二甲双胍作为抗代谢药物可通过影响肿瘤细胞内糖酵解逆转Warburg效应及对胰岛素、胰岛素样生长因子-1和瘦素的分泌,最终抑制肿瘤细胞的蛋白质合成及细胞增殖[17],抑制线粒体呼吸链中复合体Ⅰ激活AMPK/mTOR/p70S6K轴及P53蛋白磷酸化导致肿瘤细胞的周期阻滞、凋亡和自噬[18,19],在胰腺肿瘤干细胞的研究中,二甲双胍可通过增加氧化应激反应(reactive oxygen species,ROS)降低线粒体膜电位最终促进肿瘤细胞凋亡[20]。在乳腺癌及卵巢癌的研究中,二甲双胍可激活AMPK/mTOR、AKT/NF-κB来抑制多重耐药基因(multidrug resistance 1,MDR1)的转录靶向作用于AMPK/mTOR通路下调低氧诱导蛋白HIF-1α、耐药蛋白1(multidrug resistance protein 1,MRP1)及P-糖蛋白的表达逆转多重耐药[21,22]。二甲双胍可通过抑制ERK/c-JUK/NF-κB通路下调纤溶酶原激活剂uPA、热休克蛋白Hsp90α、金属蛋白酶MMP9及结合DNA的活化蛋白AP1来抑制乳腺癌[16]和肝癌[23]细胞的上皮间质转化过程。因此,选择具有药物起效浓度高和安全性好等优势[15,16]的二甲双胍联合奥沙利铂进行抗肿瘤实验,以期降低药物浓度的同时增强奥沙利铂的抗肿瘤作用。

在本研究中,对结肠癌SW480细胞应用不同浓度的二甲双胍和奥沙利铂,MTT及PI结果显示随着药物浓度增加细胞存活率逐渐降低,单独应用二甲双胍、奥沙利铂和联合使用二者处理SW480细胞时发现,与空白组及单药应用组相比联合用药组细胞存活率明显被抑制(P<0.05,见图1,2)。随后对药物处理后的不同组细胞进行了细胞周期检测,结果显示二甲双胍联合奥沙利铂组大部分细胞被阻滞在了G0/G1期(见图3)。在细胞周期进程中,cyclin-Cdk在G1期起主要作用,这些复合物能够使G1晚期的细胞跨越检查点向S期转换。在向S期转换的G0期细胞中也存在cyclin D的转录和表达。在细胞周期各阶段,不同的Cdk激酶抑制物包括P21、P57等蛋白与相应的cyclin-Cdk复合物结合抑制细胞从G1期转向S期[24]。本研究发现二甲双胍联合奥沙利铂作用组中细胞周期相关蛋白CDK4、Cyclin D1表达降低,P21表达增加,促凋亡蛋白cleaved-caspase-3表达增加同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(见图4)。

综合以上研究结果,二甲双胍联合奥沙利铂可抑制结肠癌SW480细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与细胞周期的阻滞有关。未来我们将进行动物实验进一步验证二甲双胍及奥沙利铂联合用药的抗肿瘤效应,为后续研究提供充足的理论依据,有望为结肠癌的临床治疗提供新的思路和理论支持。