HPLC-MS/MS法同时测定金线莲中5种农药残留

吴丽群，罗明可，何文胜，陈文婷

(1.福建生物工程职业技术学院中药系，福州 350002；2.福建生物工程职业技术学院药学系，福州 350002；3.福建生物工程职业技术学院健康食品系，福州 350002；4.福建生物工程职业技术学院康复保健系，福州 350002)

金线莲又名花叶开唇兰[1]，主要分布在我国福建、台湾、浙江、江西、广东、广西等省，其中以福建、台湾、浙江和江西为主产地。金线莲全草均可入药，性甘、味平，具有保肝、抗病毒、降血压、抗氧化、降血糖、抗肿瘤、提高免疫力等作用[2]。然而因其生长环境遭到人为破坏及过度采挖，致使金线莲自然资源日益减少，随着市场需求量的日益增大，人工繁育成为缓解金线莲市场供应不足的有效途径之一。目前用于金线莲人工种植的技术已相当成熟，但是受到高密度栽培的影响，金线莲在大田种植过程中极易发生病虫害。为了保证金线莲的品质和产量，降低种植成本，农药的使用是无法避免的，这就会带来农药残留的问题。金线莲的种植过程中，主要用到的农药有多菌灵、精甲霜灵、戊唑醇、腈菌唑、三唑磷、吡虫啉、百菌清、甲基托布津和土霉素等[3-4]。 我国现有的中草药中农药残留检测的方法主要是参照2015年版《中华人民共和国药典》(简称《药典》)四部通则2341农药残留检测法。对比金线莲病虫害防治用到的主要农药，其中戊唑醇、精甲霜灵、甲基托布津、土霉素、阿维菌素不在《药典》通则2341农药残留检测法的列表中。 目前针对金线莲中农药残留检测的文献较少， 沈廷明等[5]用GC法测定金线莲中六六六和滴滴涕农药残留； 刘洪波等[6]用浊点萃取技术结合GC-MS法测定了金线莲中5种拟除虫菊酯类农药的残留； 宋晓丹[7]用HPLC法检测了金线莲中多菌灵、 甲基托布津和土霉素的残留量。

QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)技术是一种快速、简单、低成本的样品处理方法，该方法采用提取液直接加入吸附剂进行净化，经离心后对上清液进行检测[8]。HPLC-MS/MS法测定农药残留在国内外屡见报道[9]，此方法不仅有较高的灵敏度，并且具有可以同时进行定性确证和定量分析等优点。因此，本研究采用QuEChERS前处理法，结合HPLC-MS/MS法，建立了一套快速、操作简单、有机溶剂用量少、回收率及精密度高的方法，可同时检测金线莲中戊唑醇、精甲霜灵、甲基托布津、土霉素和阿维菌素5种农药残留，现报道如下。

1 材 料

1.1 仪器 1290 Infinity HPLC仪(美国Agilent公司)；API5500质谱系统(配电喷雾离子源，美国AB公司)；CR21N型落地式高速冷冻离心机(日本HITACHI公司)；涡旋混合器(德国IKA公司)；XSE204型万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HM100 刀式研磨仪(北京格瑞德曼公司)。

1.2 药品和试剂 阿维菌素(浓度 100.0 μg/ml，批号S024919)、甲基托布津(浓度100.0 μg/ml，批号S022255)、精甲霜灵(浓度100.0 μg/ml，批号S018827)、戊唑醇(浓度103.0 μg/ml，批号S030729)和土霉素(浓度100.0 μg/ml，批号ALT600353)标准溶液(天津阿尔塔科技有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；甲酸(色谱纯，上海阿拉丁公司)；吸附剂石墨化碳(GCB，批号J0423-G2)、N-丙基乙二胺(PSA，批号J04S13BMX，苏州纳谱分析技术有限公司)；无水硫酸镁(国药集团化学试剂有限公司)；超纯水用Milli Q系统(美国Milipore公司)自制。实验用到的金线莲干制品分别购自福建虎伯寮药业有限责任公司(批号20190606)、南靖灵兰农业开发有限公司(批号20190624、20190903、20191201)、厦门市珍芝莲生物科技有限公司(批号20190923、20191202)、莆田市仙游县森汶农业开发有限公司(批号20190918)。新鲜品购自贡享本草(永泰)生物科技有限公司福建省福州市永泰县芋坑基地(批号20191229)和嵩口基地(批号20191209)、龙岩市连城县基地(批号20191228)。干制品和新鲜品均经福建生物工程职业技术学院中药教研室高华娟讲师鉴定为真品。

2 方法和结果

2.1 标准工作液的配制 精密吸取5种农药的标准溶液适量，用乙腈稀释并定容，配制混合标准工作液，其中土霉素、精甲霜灵的浓度为1.0 μg/ml，戊唑醇的浓度为5.0 μg/ml，阿维菌素的浓度为25.0 μg/ml，甲基托布津的浓度为2.5 μg/ml。配制好的溶液于-20 ℃下避光保存。另准确吸取5种农药的标准溶液适量，分别用乙腈配制成浓度为50 μg/L的各种待测物的标准工作液，用于质谱条件的优化。

2.2 色谱及质谱条件

2.2.1 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱：0～1.0 min，90% A；1.0～3.0 min，90%～70% A；3.0～5.0 min，70%～30% A；5.0～8.0 min，30%～10% A；8.0～14.0 min，10% A；14.0～15.0 min，10%～90% A；15.0～17.0 min，90% A；柱温30 ℃；流速0.2 ml/min；进样量2 μl。

2.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式；离子源温度450 ℃；电喷雾电压4500 V；气帘气压20 psi(1 psi=6.894 76 kPa)；雾化气压50.0 psi；辅助气压50.0 psi；碰撞室入口电压9.0 V；碰撞室出口电压15.0 V；采用多反应监测扫描(MRM)模式，5种农药的测定参数见表1，MRM谱图见图1。

2.3 样品的制备及测定 金线莲干制品的制备：取不少于100 g的金线莲干制品，置于刀式研磨仪中，以8000 r/min的速度充分捣碎混匀2 min后，过200目筛，分装入洁净的密封袋中，密封避光保存。 金线莲新鲜品的制备：取不少于 100 g的新鲜金线莲，置于刀式研磨仪中，以8000 r/min 的速度充分捣碎混匀2 min后，分装入聚四氟乙烯塑料瓶中，密封后于-18 ℃保存。

表1 多反应监测扫描模式测定 金线莲中5种农药的质谱分析条件Table 1 Analysis conditions of mass spectrometry for determination of five pesticide residues in Anoectochilus roxburghii by multiple reaction monitoring scanning mode

准确称取已粉碎的金线莲样品5.00 g于50 ml离心管中，干制品加入10 ml水涡旋混匀并静置30 min (新鲜品不需加水)。精密加入10 ml乙腈，混匀，再加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠及1 g柠檬酸三钠，盖上离心管盖，剧烈振摇2 min后以1.3×104×g离心5 min。取5 ml上清液于15 ml离心管中，并加入900 mg无水硫酸镁、150 mg PSA及45 mg GCB，涡旋1 min后以1.3×104×g离心5 min，取上清液过0.22 μm的滤膜，上机待测。

2.4 线性关系考察 以不含5种待测农药残留的金线莲干制品作为空白样品， 按照 2.3 项下方法处

理得空白基质溶液，以空白基质溶液配制不同浓度的混合标准工作液进行测定，以5种农药的质量浓度为X轴，定量离子的峰面积为Y轴，绘制工作曲线，得到线性回归方程及相关系数(r)，结果见表2。

2.5 回收率和精密度实验 在空白金线莲干制品中添加低、中、高浓度的混合标准溶液，每个添加浓度平行制备6份样品，按2.3项下方法处理样品，再按2.2项下色谱和质谱条件测定，计算回收率及精密度，结果见表3。5种农药的平均加样回收率为72.7%～94.9%，RSD为1.8%～10.3%(n=6)。

2.6 检测限和定量限 精密称取同一批(批号20190606)已粉碎的金线莲干制品5.00 g，加入2.1项下配制的混合标准工作液适量，按2.3项下方法处理样品，再按2.2项下色谱和质谱条件进样，以3倍的信噪比(S/N)和10倍的信噪比来确定方法的检测限(LODs)和定量限(LOQs)，结果见表2。

2.7 样品中农药残留量的测定 分别取从市场上购买的7批金线莲干制样品和3批金线莲新鲜品进行检测，按2.3项下方法处理后，再按2.2项下色谱和质谱条件测定，结果批号为20190918的金线莲干制品检出甲基托布津，含量为84.4 μg/kg；批号为20191209的金线莲新鲜品检出甲基托布津和精甲霜灵，含量分别为96.8和38.6 μg/kg。

表2 5种农药的线性关系考察结果Table 2 Linear relationship of five pesticides

表3 5种农药的加样回收率和精密度实验结果Table 3 Results of recovery and precision tests of five pesticides (n=6)

3 分析和讨论

3.1 色谱和质谱条件的选择 预实验中采用直接进样的方式，分别将浓度为50 μg/L的各种待测物的标准工作液注入离子源，每种待测物选择两对响应值高的特征离子对作为定量及定性的离子对，并对MRM参数进行优化。同时优化了色谱流动相，结果发现，以水-乙腈作为流动相，5种待测物的峰型较好，无拖尾现象，故本研究选用水-乙腈体系作为流动相。在正离子模式下，甲酸可以增大目标离子的离子化效率，并能改善峰型，故本研究以加入0.1%甲酸的乙腈作为HPLC法梯度洗脱中的有机流动相。

3.2 提取溶剂的选择 5种待测物的化学结构差异较大，但都易溶于有机溶剂，因此本研究选择常用的乙腈、甲醇、丙酮进行提取效果考察。相对于其他溶剂，乙腈去除杂质的效果及对农药的提取效率最佳，因其渗透性强，溶解性能良好，不仅能提高5种农药的回收率，而且能减少提取液中色素、蛋白质、多糖等共萃取物的含量，有利于后续的净化，因此本研究选择乙腈作为提取剂。另外在研究中发现，对于金线莲干制品，提取前加水浸泡可以提高对农药残留的提取效率，但随着水量的增加，回收率开始降低。可能的原因是，当加水浸泡后，金线莲粉末充分泡开，便于待测物溶出；而水量太多时，有机溶剂相对较少， 根据“相似相溶”原理推测， 不利于待测物的提取。 最终选择用10 ml的水量浸泡金线莲干制品。

3.3 样品净化条件的选择 金线莲中含有大量的色素、多糖、有机酸等物质，为了减少这些物质对后续液相色谱柱和质谱系统的污染，并确保检测结果的准确性，提取液必须进一步净化。PSA可有效去除糖类、酚类、脂肪酸和少量色素。GCB可有效去除色素、维生素类、固醇类和一些具有平面结构的干扰物质。本研究参照文献[10]，选择900 mg无水硫酸镁、150 mg PSA及45 mg GCB作为QuEChERS法的净化剂。研究结果表明，经净化后的提取液颜色明显变浅，且5种农药的加样回收率均>70%，说明该净化方法可用于这5种农药残留量检测时样品的净化。