水酶法制备栀子油的研究

孟祥河 刘晓颖 邹 盈 邵圣鑫

(浙江工业大学食品科学与工程学院1 ，杭州 310014)(温州科技职业学院2 ，温州 325006)

栀子是茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实，主要分布在我国长江以南的一些省份[1]。栀子作为中药，它的根、叶、花和果实都可入药，是我国卫生部颁发的第一批药食两用的药材[2]。栀子富含多种生物活性物质，其中栀子黄作为一种水溶性类胡萝卜素，是广泛使用的天然食用色素[3]。栀子苷因为抗炎活性和保肝利胆的作用应用较为广泛[4, 5]。目前栀子果实的利用主要集中在栀子黄色素、栀子苷方面，萃取后的栀子残渣常被作为废弃物丢弃，会造成了宝贵资源的浪费。除上述活性成分外，栀子还含约20%的栀子油。与其他植物油相比，栀子油稳定性好，饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸组成天然接近1∶1∶1，且栀子油中富含角鲨烯、甾醇等活性物质。

目前栀子油提取方法主要是压榨法与溶剂提取法。压榨法设备简单，但产率低；溶剂提取法提取率高，但存在环境问题及溶剂残留引起的安全担忧。杨冀艳等[6]还对采用超声波辅助石油醚提取鲜栀子湿果条件进行了研究，发现以石油醚为溶剂，液料比10∶1、提取45 min、重复提取3次，栀子油得率可达16.49%。超临界萃取近年来发展较快，具有绿色、安全等优点，日益受到研究人员的关注。例如王小燕[7]等尝试了采用超临界CO2萃取技术从栀子果中提取栀子油，其得率(22.95%)优于石油醚提取的有机溶剂法(16.67%)。超临界CO2萃取完成后无试剂残留，残渣可以进一步用于分离栀子黄、栀子苷等活性成分。但由于超临界萃取设备昂贵，处理量小，操作相对复杂，生产规模较难扩大化，且成本偏高因此目前在工业生产中不具备优势。水酶法通过酶作用破坏油料作物的细胞壁，促进植物细胞中的油脂的释放，是一种有望应用的提油新技术。与其他工艺相比，水酶法具有反应条件温和，油脂品质高，且能有效释放其他活性成分，工艺高效、安全，易于放大等优点，对于提取栀子黄色素后剩余的残渣中油脂的提取较为适合。

本研究以栀子为原料，采用超声辅助溶剂提取制备栀子苷和栀子黄，然后对栀子渣采用水酶法提取栀子油，初步实现了栀子的综合利用。同时比较了水酶法、传统压榨法、溶剂萃取法制得的栀子油的品质。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料与试剂

黄栀子脱壳后经高速粉碎机粉碎过40目筛得到栀子粉末。栀子苷标品(≥98%)、栀子黄标品(≥95%)、角鲨烯标品(≥98%)、甾醇标品(≥90%)、生育酚标品(≥96%)、纤维素酶(10 000 U/g)、果胶酶(30 000 U/g)、Alcalase 2.4L碱性蛋白酶(24 000 U/g)。甲醇、正己烷为色谱纯；乙醇、异丙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、乙醚均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

万能高速粉碎机，KQ-2200型超声波清洗器，CA 59 G KOMET榨油机，HJ-6B恒温数显恒温磁力搅拌水浴锅，RE-2000A旋转蒸发器，循环水真空泵，Waters E2695高效液相色谱仪，Thermo TRACE-1300 气相色谱-质谱联用仪。

1.2 方法

1.2.1 栀子果中栀子苷、栀子黄的溶剂提取方法

栀子粉末(40目)以1∶5的料液质量比分散于50%～90%的甲醇、乙醇或异丙醇溶液中，20 ℃恒温超声(功率100 W、频率40 kHz)处理30 min，取滤液适当稀释定容，用于HPLC分析，根据栀子苷、栀子黄标品的标准曲线计算栀子苷、栀子黄的含量。结果以3次独立平行实验结果的平均值计算，栀子苷、栀子黄得率用提取得到的成分质量占栀子原料的百分比表示，栀子苷、栀子黄的提取率为其萃取含量/栀子中该成分理论含量×100%。

HPLC分析栀子苷、栀子黄的方法：上述提取液通过0.22 μm膜微滤，使用Waters E2695 HPLC分析。色谱柱为Agilent SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶水=50∶50，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。栀子苷和栀子黄检测波长分别为240 nm和440 nm。由栀子苷、栀子黄标品确定出峰时间分别为3.46 min和7.47 min。

1.2.2 压榨法和正己烷提取提取栀子油

压榨法：栀子籽(含水量5%)直接加入冷榨机，转速25 r/min，在温度低于70 ℃条件下压榨，压榨后经4 500 r/min 离心10 min即得到压榨栀子油。油脂得率为油脂质量/栀子籽质量×100%。

正己烷提取法：称取栀子粉末于索式抽提器中，加入正己烷在80 ℃水浴中抽提6 h，得到的油脂和溶剂的混合物经45 ℃旋转蒸发获得栀子油，称重、计算栀子油得率。

1.2.3 水酶法提取栀子油

单一酶水解：栀子残渣与蒸馏水按料液质量比1∶7混合，在90 ℃水浴中灭酶10 min，用0.1 mol/L氢氧化钠调pH至适宜pH(相应酶的最适pH)，分别添加纤维素酶、果胶酶或蛋白酶，在各自最适温度下酶解。酶解结束后90 ℃灭酶10 min，冷却至室温，样液离心(8 000 r/min、30 min、4 ℃)，收集上层清油。

多酶水解：栀子渣溶液灭酶后，调节pH至第一步水解酶的适宜pH，添加适量该酶水解。酶解结束后，调节pH至第二种酶制剂的最适pH，添加适量该酶特定温度下水解既定的时间。酶解结束后灭酶10 min，冷却至室温，样液离心，收集上层清油。

1.2.4 栀子油理化指标分析

栀子油酸价测定参照AOCS-cd-3d-63方法测定[8]；栀子油过氧化值测定：参照AOCS-cd-8-53方法测定[9]；栀子油碘值的测定：参照AOCS-cd-1d-92方法测定[10]。栀子油中角鲨烯、生育酚、甾醇测定：0.2 g油样中加入1.0 mol/L KOH-乙醇溶液50 mL，在80 ℃水浴下回流40 min，加入50 mL温水后再加入50 mL乙醚趁热充分振荡2 min，转移至分液漏斗静置分层，上层为乙醚提取液，将下层皂化液再用40 mL乙醚萃取2次，合并3次乙醚提取液，用去离子水洗至下层流出液加酚酞试剂不变色，用无水硫酸钠除水后，溶剂经减压回收得到不皂化物。不皂化物溶解于正己烷溶剂定容至5 mL，过0.22 μm有机微膜，用于GC-MS分析。

GC-MS条件：色谱柱：TG-5 (30 m×0.25 mm×0.20 μm)；升温程序：170 ℃，保持1 min；以8 ℃/min升温至280 ℃，保持20 min；载气(He)流速：1.0 mL/min，进样量：1 μL，分流比：20∶1。含量根据角鲨烯、生育酚、甾醇相应标准曲线计算，以每百克油中含量计(mg/100 g)。

1.2.5 栀子油脂肪酸组成分析

甲酯化：0.1 g样品油与4 mL、0.5 mol/L NaOH-CH3OH溶液充分混匀，在75 ℃水浴中回流15 min，再向其中加入5 mL、55% BF3-CH3OH充分混匀，继续回流2 min，加2 mL色谱纯正己烷，1 min后加15 mL饱和NaCl，振荡15s后，趁热转移至50 mL容量瓶中，加入饱和NaCl至容量瓶颈部，加5 mL色谱纯正己烷，摇匀，静置移取上清液，0.22 μm有机微膜过滤，用于GC-MS分析。脂肪酸组成定性采用与NIST数据库比对，面积归一法定量。

GC-MS条件：色谱柱：DB-WAX (60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：90 ℃，保持5 min；以10 ℃/min升温至200 ℃，保留至10 min；以0.5 ℃/min升温至220 ℃，保留时间5 min，以5 ℃/min升温至240 ℃，保持10 min；载气(He)流速：1.0 mL/min，进样量：1 μL，分流比：20∶1。

2 结果与讨论

2.1 栀子果溶剂预萃取分离栀子苷和栀子黄的研究

在食品医药工业上，栀子主要用于制备栀子黄色素和栀子苷。本研究探讨栀子果溶剂萃取预处理，一方面可高效回收活性成分栀子黄、栀子苷，同时可减少后续水酶法萃油时两性的栀子苷引起的乳化，提高栀子油得率。

2.1.1 萃取溶剂及其体积分数对栀子苷和栀子黄得率的影响

研究食品制药工业常用的甲醇、乙醇、异丙醇溶剂萃取效果。不同的浓度的3种醇溶液料液比1∶5，25 ℃超声萃取30 min栀子苷、栀子黄得率如图1所示。对于栀子苷的提取，在50%～90%体积分数范围内随着甲醇、乙醇、异丙醇体积分数的增加，栀子苷得率逐渐增加。达到最大值后，溶剂体积分数进一步增加，栀子苷得率有所下降。最佳甲醇体积分数为70%，栀子苷得率为5.43%；而乙醇、异丙醇最适萃取体积分数为60%，相应的栀子苷得率分别为5.48%、4.98%。而对于栀子黄的提取，甲醇、乙醇、异丙醇的最佳萃取体积分数均为60%，其中60%乙醇的栀子黄得率最高，为6.07%，甲醇、异丙醇的栀子黄得率接近，约为5.2%。栀子黄为水溶性色素，易溶于水，而栀子苷同样易溶于水但也在甲醇、乙醇、异丙醇等醇溶液中也具有一定溶解性；溶剂体系中醇体积分数较低时，亲醇性物质与栀子苷、栀子黄竞争水分能力较强，而随着醇体积分数的上升，水在溶剂体系中占比降低，栀子苷与栀子黄在水中的体积分数逐渐过高而导致物料与溶液体积分数差减小，得率因此降低。考虑到不同浓度的甲醇对栀子黄提取效果差异不明显，因此萃取条件优化实验中，分别采用70%的甲醇、60%的乙醇、60%的异丙醇。

图1 萃取溶剂及体积分数对栀子苷和栀子黄得率的影响

2.1.2 料液比对栀子苷和栀子黄得率的影响

不同料液比的3种醇溶液对栀子黄与栀子苷的得率如图2所示。结果显示，栀子黄、栀子苷得率均随着料液比的增加而增加并逐渐稳定。随着萃取溶剂用量增大，栀子渣料与溶剂中的栀子苷与栀子黄的浓度差越大，扩散速度越快，产物得率越高。而溶剂用量过大时，相同的萃取时间内得率变化不明显。用60%乙醇萃取，当料液比达到1∶7时栀子苷、栀子黄的得率逐渐稳定，约为6.62%、7.34%；而70%甲醇在料液比为1∶7时，相关得率逐渐稳定在5.22%、6.11%；1∶6的料液比下60%异丙醇对应的栀子苷与栀子黄的得率分别为6.11%、6.71%。虽然继续扩大料液比以及延长萃取时间栀子苷与栀子黄的得率略微增加，但过多的溶剂消耗及浓缩成本增加。因此确定60%的异丙醇的最佳料液比为1∶7的，60%的乙醇、70%的甲醇的适宜料液比为1∶6、1∶7。

图2 不同料液比对栀子苷和栀子黄得率的影响

2.1.3 三种溶剂不同萃取时间下栀子苷和栀子黄的得率

超声辅助条件下，70%甲醇、60%乙醇、60%异丙醇溶液萃取栀子苷、栀子黄的时间进程曲线如图3所示。随着萃取时间延长，栀子黄、栀子苷的得率均逐渐增加并最终达到平衡。对于栀子苷，异丙醇在20 min即达到萃取平衡，得率为6.30%；乙醇、甲醇则分别需25、30 min 达到萃取平衡，栀子苷得率分别为6.84%，5.76%。对于栀子黄，甲醇、乙醇、异丙醇萃取平衡均落在25～30 min之间，其中乙醇、异丙醇萃取率较佳，分别为8.23%、8.18%，甲醇25 min达到萃取平衡，栀子黄得率为6.55%。

目前关于栀子苷、栀子黄提取优化主要采用有机溶剂浸提方法。胡震等[11]用80%乙醇回流提取，料液比为1∶5，提取1次，提取时间1 h，栀子苷得率为2.53%。黄建军等[12]比较了水提法和有机溶剂浸提法对栀子黄色素提取效果的影响，采用甲醇水溶液作浸提剂，在常温下浸提24 h，栀子黄色素得率可以达到11%～12%。游剑等[13]采用正交实验优化了溶剂提取栀子苷工艺条件。60%乙醇以1∶4的料液比，在75 ℃下提取3 h，得率达12.59%。游剑等[14]也比较了直接浸泡法、渗漉法、回流提取法、超声法和微波法不同工艺对栀子苷提取效果的影响。结果表明，回流提取法的效果最好，料液比为1∶3，60%乙醇在65 ℃下提取2 h，栀子苷得率为11.69%。超声辅助溶剂提取法相较于传统溶剂法来说，具有提取率高、高效省时、常温提取等优点。张德权[15]等比较了超声振荡法、索式提取法和水浴回流法对栀子甙提取效果的影响，结果表明用甲醇-水溶液(1∶1)超声提取1 h，栀子甙得率最高为3.315%。不同文献栀子苷和栀子黄得率略有差异，是源于使用不同的栀子原料和检测方法。本研究通过超声辅助60%乙醇溶液预萃取处理25 min，初步可以实现栀子苷、栀子黄79%～89%的提取率；超声辅助60%异丙醇溶液预萃取20 min基本能实现栀子苷与栀子黄78%～82%的提取率。

图3 超声波辅助萃取时间对栀子苷和栀子黄得率的影响

图4 不同溶剂预处理后栀子渣纤维素酶水解的栀子清油得率

2.1.4 不同溶剂预处理后残渣水酶法制油的清油得率

采用优化后的超声辅助70%甲醇、60%乙醇、60%异丙醇预处理后所得的栀子渣(无溶剂预处理栀子粉为照组)分别采用纤维素酶50 ℃水解2 h，栀子油清油得率如图4所示。对照组由于乳化显现严重，清油产率仅为9.42%。实验组甲醇、乙醇、异丙醇预处理后，酶解液分层明显，栀子油清油得率有所改善，分别提高至10.17%、10.14%、12.06%，表明溶剂预萃取不仅高效回收了生物活性的栀子苷、栀子黄成分，对改善后续栀子渣水酶法制油也具有积极作用。典型的溶剂预处理对水酶法过程中乳化程度的直观影响见图5。栀子果中含有较多的两性栀子苷、果胶、多糖等物质，酶水解时这些物质释放到溶液中会促进栀子油、水乳化，降低清油产率。醇溶液预萃取一定程度脱除了这些物质，因此起到了改善水酶法制油效果。综合考虑栀子黄、栀子苷的提取率以及后续水酶法清油得率，实验确定栀子预处理条件为60%异丙醇溶液、料液比为1∶6，超声辅助萃取20 min。

图5 溶剂预处理对水酶法水解过程中乳化的影响

2.2 栀子渣中栀子油的水酶法提取研究

2.2.1 不同酶种类及其分步酶解对栀子清油得率的影响

在大豆、菜籽、花生等常见的油料作物中油脂滴主要包裹在蛋白、淀粉、多糖中，或形成结合态[16]。而栀子果中蛋白含量很低，纤维素、木质素、果胶、半纤维素丰富，油滴被包围在其中，部分脂质与蛋白质结合形成脂蛋白复合物。因此栀子油的释放的关键在于纤维素酶或果胶酶对细胞壁的酶解破坏以及蛋白酶对脂蛋白的水解程度。本实验所用栀子果理论粗脂肪质量分数为18.10%。不同种类酶一步水解及其组合酶的分步水解效果如表1所示。数据显示，对照组不添加水解酶(水代萃取法)清油得率低至5.2%，这可能是栀子粉碎使部分细胞破损，曝露的油脂被水替代而释放出来。而大部分油脂仍保留在完整的组织细胞内，水分很难穿透细胞壁取代细胞内油脂。纤维素酶、果胶酶、蛋白酶水解均提高了栀子清油产率，且栀子油得率在12.42%～15.96%之间。目前鲜有水酶法制备栀子油的数据可比较，但单一酶解清油得率已明显高于压榨法及超临界CO2萃取法。Cai等[2]在室温下通过冷榨法提取栀子油，将冷榨的油以5 000 r/min 离心10分钟除去杂质，清油得率为5.66%。李宝莉等[17]优化超临界CO2萃取栀子油工艺发现，萃取压力25 MPa、解析釜I压力12 MPa、萃取温度45 ℃、解析釜I温度45 ℃栀子油得率为12.0%。类似的，包亚妮等[3]发现超临界CO2萃取压力35 MPa、萃取温度55 ℃、CO2流速13 kg/h时，栀子油得率为10.89%。

目前绝大多数研究仍集中于溶剂萃取。如袁源见等[18]采用响应面中心设计法优化了超声波辅助石油醚提取栀子油工艺参数，液料比11.62∶1、单次提取28.7 min、重复提取3.36次，栀子油得率为13.50%。刘瑞英[19]以石油醚为溶剂在料液比1∶7，80～86 ℃回流萃取，栀子出油率提高至12.36%。张风波等[20]优化石油醚萃取栀子油工艺发现，料液比1∶5，81 ℃萃取4 h栀子油得率为19.21%。而辛莎[21]用90～120 ℃的石油醚提取栀子油，栀子粉粒度60目、料液比1∶6、100 ℃、1.5 h栀子油得率为19.46%，但需要二次提取。总体来讲，不同提取方法栀子油产率不同，此外也可能与采用的栀子种类不同有关，但得率多在10%～20%之间，但溶剂萃取带来的工艺安全及产品安全隐患仍是不期望的。

本研究中，双酶组合分步水解进一步改善了栀子清油得率。如纤维素酶、蛋白酶组合水解后清油得率提高至15.96%，果胶酶、蛋白酶组合清油得率略低约为14.52%，暗示单一酶不足以完全破坏栀子果组织细胞、完全释放栀子中的油脂。当不同类型的酶耦联在一起时，协同降解栀子组织效果显现，因此脂质产率显著增高。纤维素酶、果胶酶组合清油得率(13.03%)虽然相对于单酶水解也有所改善，但不如前两组效果明显。这可能是这两种酶作用的底物均为碳水化合物有关。双酶水解得到栀子油的得率几乎可与溶剂萃取法相媲美，同时栀子组织降解彻底，更利于栀子中活性脂类伴随物的释放，显示出水酶法制油高效、营养、安全的优势。

表1 单酶水解与多酶水解对栀子油清油得率的比较

2.2.2 水解液中栀子苷、栀子黄含量

实验所用栀子原料中栀子苷、栀子黄中含量分别为7.68%和10.45%的，异丙醇溶液预萃取基本能实现78%～82%的栀子苷与栀子黄的提取率，余下的则可能仍被包裹在栀子渣中。酶水解时栀子渣组织分解，未被萃取的栀子黄、栀子苷进一步释放至水溶液中，可用于后续回收。不同的水解酶酶解，栀子苷、栀子黄释放程度可能不同，具体数据参见表2。结果显示，果胶酶水解释放的栀子苷、栀子黄数量要多于纤维素酶和蛋白酶，含量分别为0.61%和1.52%。有报道显示，纤维素酶可能催化栀子苷水解，而蛋白酶可能催化京平尼、氨基化合物反应生成栀子蓝色素[22]，因此导致水解液中栀子苷含量偏低，也会引起栀子黄绿化导致栀子黄降低[23]。这一点在双酶分步水解时有所显现。酶、底物作用时间延长，因此水解液中栀子苷、栀子黄含量进一步降低。水解前溶剂预萃取加上水酶法释放，栀子苷、栀子黄的释放率最高可达87%及86%，完全满足栀子综合利用的要求。

2.3 不同提取方法获得的栀子油品质比较

压榨法，溶剂萃取法以及水酶法提取的桅子油的主要成分构成以及品质参数见表2所示。数据显示，栀子油中最主要脂肪酸分别为亚油酸(37.02%～40.39%)、油酸(34.00%～35.08%)、棕榈酸(18.33%～19.16%)，此外含有少量的硬脂酸(3.66%～4.28%)、亚麻酸(0.77%～1.08%)，二十碳烯酸(1.65%～2.38%)，其中饱和脂肪酸/单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸比例接近0.6∶1∶1。三种制备方法得到的栀子油脂肪酸组成差异不明显。溶剂萃取法和水酶法制得油脂酸价略高于压榨法，但碘价略低。对于过氧化物值，溶剂萃取法栀子油最高，这与油脂经溶剂热处理有关。但化学指标均符合食用油品质国家标准。微量营养方面，水酶法提取的栀子油中油脂伴随物明显偏高。如角鲨烯含量为600 mg/100 g，高出压榨法及溶剂萃取组约33%～37%，为超临界CO2萃取组的12倍。生育酚含量(39.74 mg/100 g)略微低于压榨法及超临界萃取法获得的栀子油(45.33，47.94 mg/100 g)，但显著高于溶剂萃取组(34.93 mg/100 g)。栀子油中的甾醇主要为β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇，其中β-谷甾醇、菜油甾醇含量分别约为豆甾醇含量的3倍。其中超临界CO2萃取法栀子油甾醇含量最低(627 mg/100 g)，其次为溶剂萃取法和压榨法(1 070、1497.4 mg/100 g)，水酶法最高(1 651.4 mg/100 g)，约为超临界CO2萃取法的2.6倍。较高的脂质伴随物，暗示了水酶法栀子油相对于压榨法及溶剂萃取法更好地保存了栀子的活性成分，具有更高的营养价值。

表2 3种方法提取的栀子油的理化性质和脂肪酸组成的比较

3 结论

超声辅助溶剂预萃取栀子苷、栀子黄，剩余果渣采用水酶法萃取油脂可以实现栀子高效综合利用，改工艺绿色、安全、可行。最优条件下可实现86%～87%的栀子苷、栀子黄回收率，15.96%的栀子油得率。油脂产率优于传统压榨法甚至可与有机溶剂萃取法相媲美。不同提取方法所得栀子油的理化及组成分析表明，水酶法提取的栀子油的酸价、碘价、脂肪酸组成与压榨法及溶剂萃取法产品差别不大，过氧化物值略低。此外水酶法栀子油脂质伴随物含量明显高于其它方法，尤其富含抗氧化的角鲨烯及高降血脂活性甾醇类及适量VE，显示出水酶法栀子油更高的营养价值。