维甲酸X受体对缺氧/复氧诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬的调控作用*

高 慧， 周卓琳 ， 楼国强， 张晶晶， 武垣伶， 黄丹娜 ， WU Yi-ming， 王万铁△

（1温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所，浙江温州325035；2河南大学附属淮河医院病理科，河南开封475000；3Division of Cardiovascular Medicine，University of Iowa Carver College of Medicine，Iowa City，IA 5009，USA）

肺缺血/再灌注损伤（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）是指肺组织在缺血一段时间后恢复血流供应，组织损伤加重甚至发生不可逆性损伤的现象，是威胁患者预后乃至生命的重要因素［1］。LIRI 的发生发展最终是由肺细胞的损伤来体现的，因此肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial cell type Ⅱ，AECⅡ）的缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）与机体的LIRI有类比性。细胞自噬是真核生物体内进化高度保守的细胞自稳程序［2］，近年来被证实参与了某些脏器缺血再灌注损伤的病理生理过程［3］。因此，研究细胞自噬可能对肺缺血/再灌注（缺氧/复氧）损伤的防治有一定意义。

维甲酸X 受体（retinoid X receptor，RXR）是细胞核受体超家族中的重要成员之一，包括α、β 和γ 三个亚型，在细胞生物学的特定方面如细胞增殖、凋亡等多种细胞过程中扮演重要角色［4-5］。研究表明，RXRα 在多种疾病过程中发挥重要作用，激动RXR可以抑制缺氧/复氧引起的心肌细胞损伤［6-7］，但对于RXR 在肺细胞缺氧/复氧损伤中的调节作用目前国内外尚未见报道。本实验通过对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行H/R 处理，模拟人体LIRI 这一病理生理过程，并使用RXR 激动剂和抑制剂进行干预，探讨RXR 在H/R 诱导的细胞自噬过程中可能发挥的作用以及调节机制，从而为肺缺血/再灌注损伤的研究和防治提供参考资料。

材料和方法

1 实验细胞

本实验细胞为大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，由上海拜力生物科技有限公司提供。

2 主要试剂及仪器

高糖DMEM 培养液、胎牛血清和胰蛋白酶（Gibco）；9-顺式维甲酸（9-cis-retinoid acid，9-RA）和HX531（Sigma）；抗 RXRα、p-AMPK、p-mTOR、beclin 1、LC3-Ⅱ和P62抗体（Abcam）；辣根酶标记山羊抗兔Ⅱ抗（上海博蕴生物科技有限公司）；免疫荧光Ⅱ抗（上海翊圣生物科技有限公司）；引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成；BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）；CCK-8 试剂盒（Dojindo）；逆转录试剂盒（Thermo）。常氧培养箱和微量冷冻离心机（Themo）；超净工作台（苏州苏净安泰医疗器械有限公司）；多功能酶标仪、梯度PCR 仪和蛋白电泳/转膜系统（Bio-Rad）；荧光化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；透射电镜及成像系统（Hitachi）。

3 主要方法

3.1 AEC Ⅱ的培养 使用DMEM 高糖型培养液（内含10%胎牛血清、1%青、链霉素）培养细胞，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。

3.2 实验分组 按照随机数表将细胞分为5 组：对照（control，Con）组、缺氧/复氧（H/R）组、溶剂DMSO组、RXR 激动剂 9-RA 组和 RXR 拮抗剂 HX531 组。Con 组用完全培养液在常氧箱内正常培养30 h；H/R组缺氧（94% N2、1% O2、5% CO2）处理6 h，复氧处理24 h；DMSO 组在缺氧前用终浓度低于0.1% DMSO的培养液处理1.5 h；9-RA 组在缺氧处理前用9-RA（100 nmol/L）预处理1 h；HX531 组在缺氧前先用9-RA（100 nmol/L）预处理 0.5 h，再用 HX531（2.5 μmol/L）预处理1 h，其余处理同H/R组。

3.3 AEC Ⅱ缺氧/复氧损伤模型的制备 在本实验室前期的研究基础上，通过预实验整合改进构建大鼠 AEC Ⅱ的 H/R 模型［8］。将处于对数生长期，形态正常的AEC Ⅱ用不含血清的培养液饥饿处理24 h后，用于H/R 模型复制。缺氧（37℃、94%N2、1%O2、5%CO2）处理时，将含10%FBS的高糖DMEM 培养液换成经高纯氮气饱和处理过的无糖无血清培养液，营造氧糖剥夺的条件处理6 h，复制缺氧模型；再将缺氧液换成无血清的高糖DMEM 培养液，置于常氧箱（37℃、95% O2、5% CO2）恢复氧气供应培养24 h，复制复氧模型。通过以上处理，模拟细胞缺氧/复氧损伤的病理生理过程。

3.4 CCK-8 检测细胞活力 按照试剂盒说明书步骤正确操作，每孔按照1×105的细胞密度接种于96孔板，待细胞贴壁后进行各组模型复制。配制CCK-8混合液（CCK-8∶DMEM 培养液=1∶10），每孔110 μL加入样品孔，将96孔板放入常氧箱孵育0.5～2 h。再用酶标仪测定每孔在450 nm的吸光度（A）值。

3.5 免疫荧光染色法检测各组细胞RXRα 表达准备细胞爬片、4%多聚甲醛固定细胞、0.1% Triton X-100打孔、5%牛蛋白血清封闭之后，再滴加兔抗鼠RXRα 抗体低温过夜孵育，次日结合羊抗兔荧光Ⅱ抗，用DAPI 进行核染色，再用含抗荧光淬灭剂的封片液进行封片处理之后，于正置荧光显微镜下观察并拍片。

3.6 透射电镜观察细胞超微结构 各组细胞处理完毕，首先用2.5%戊二醛固定液固定30 min，收集细胞并置于4℃冰箱固定过夜。再依次经PBS 缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，1%醋酸铀块染，丙酮梯度脱水、浸透，Epon812 环氧树脂包埋剂包埋聚合，半薄切片，超薄切片，经醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，最后使用透射电镜观察并拍摄。

3.7 RT-PCR 检测自噬相关基因mRNA 的表达 用Trizol 法提取总RNA，分光光度计测定RNA 浓度，根据浓度计算上样体积。依次经逆转录合成cDNA、PCR 扩增、2.0%琼脂糖凝胶电泳、全自动凝胶成像系统曝光成像，最后用Quantity One 软件分析图像。PCR 扩增参数为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32 个循环；72℃ 5 min。此外，LC3 扩增参数为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，28个循环；72℃5 min。引物序列见表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3.8 Western blot 检测自噬相关蛋白的表达 造模结束，用预冷的PBS 缓冲液清洗3 次。每皿加1 mL裂解混合液（PMSF∶RIPA=1∶100）于冰上裂解 30 min。细胞刮适当研磨细胞，收集细胞悬液并离心沉淀，收集上清。BCA 试剂盒测定蛋白浓度后，高温下蛋白变性。进行SDS-PAGE，转膜（湿转）、10%脱脂牛奶封闭 2 h，TBST 洗膜，再结合I 抗（p-AMPK、beclin 1、p-mTOR、P62 抗体均以 1∶1 000 稀释；LC3-Ⅱ以 1∶2 000 稀释；GAPDH 以 1∶10 000 稀释），4℃孵育过夜。次日结合Ⅱ抗约1 h，TBST 洗膜3 次，滴加ECL 发光液暗室内孵育2 min，再用荧光化学发光成像系统进行曝光拍摄，用Quantity One 软件分析图像灰度值。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件分析。所有计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，并进行正态性检验。多组样本均数组间采用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组细胞活力的变化

与Con 组相比，其余4 组细胞的A值均显著下降（P＜0.05）；与DMSO 组相比，9-RA 组的A值显著上升（P＜0.05）；与 9-RA 组相比，HX531 组的A值显著降低（P＜0.05）；而H/R、DMSO 和HX531 组之间两两相比，A值无显著差异（P＞0.05），见图1。

Figure 1.The expression change of A value in all groups.Mean±SD. n=5.▲▲P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs H/R group；**P＜0.01 vs DMSO group；△△P＜0.01 vs 9-RA group.图1 CCK-8法检测的各组细胞A值变化

2 免疫荧光法检测各组细胞RXRα表达的结果

荧光显微镜下可见，与Con 组相比，其余4 组细胞中的 RXRα 表达增多；而与 DMSO 组相比，9-RA 组的 RXRα 表达增多；与 9-RA 组相比，HX531 组细胞的 RXRα 表达显著减少；而 H/R、DMSO和HX531 3组两两相比，细胞中RXRα 表达无显著差异（P＞0.05），见图2。

3 各组细胞电镜观察结果

透射电镜下可见，Con组肺泡Ⅱ型上皮细胞结构未见异常，线粒体结构呈梭形，结构正常，数目丰富且嵴线清晰，板层小体丰富且结构正常；与Con 组相比，其余4 组细胞内部结构出现不同程度的紊乱，其中H/R、DMSO 和HX513 3 组肺泡Ⅱ型上皮细胞内线粒体发生高度水肿，线粒体嵴线溶解甚至消失，偶见变异性的增生，板层小体出现空泡化且数目减少，可观察到自噬溶酶体、降解性细胞自噬体出现；9-RA组相较于 H/R、DMSO和HX531 3 组，肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤减轻，线粒体仅出现轻微肿胀，结构相对较为完整，板层小体数目较多且结构正常，未观察到细胞自噬小体，见图3。

4 各组细胞RT-PCR检测结果

与 Con 组相比，其余 4 组细胞的 AMPK、beclin 1和LC3 mRNA 表达均显著增多，mTOR 和P62 mRNA表达显著减少（P＜0.05）；与H/R、DMSO 和HX531 组相比，9-RA 组的 AMPK、beclin 1和LC3 mRNA 表达水平显著下降，而mTOR 和P62 mRNA 表达显著增多（P＜0.05）；H/R、DMSO 和HX531 3 组两两相比，各个自噬基因的mRNA 表达变化无显著差异（P＞0.05），见图4。

5 各组细胞Western blot检测结果

与Con 组相比，其余4 组细胞的p-AMPK、beclin 1 和LC3-Ⅱ蛋白表达均有显著增多，p-mTOR 和P62蛋白表达显著减少（P＜0.05）；与 H/R、DMSO 和HX531 组相比，9-RA 组的 p-AMPK、beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平显著下降，而p-mTOR、P62 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；H/R、DMSO 和HX531 3 组两两相比，各个自噬基因蛋白的表达变化无显著差异（P＞0.05），见图5。

讨 论

肺缺血再灌注损伤作为一种机制极为复杂的病理生理过程，目前尚无特异性防治措施，但药物预处理、抑制NF-κB 和前列腺素E1 预处理等可在一定程度上缓解LIRI［9-11］。而对于肺组织的主要效应细胞，AECⅡ的缺氧/复氧损伤可以模拟肺的缺血再灌注损伤。近年来，大量研究表明缺血再灌注（缺氧/复氧）损伤的发生发展可能受自噬相关基因（autophagy associated gene，ATG）和自噬信号通路的调控［12］。

本研究选择了多个自噬通路上有典型指示作用的自噬相关蛋白。在自噬信号通路中，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是上游的能量和营养感受器。当组织细胞营养缺乏时，ATP 减少而AMP增多，AMPK 活性增加，而mTOR 失活并释放UNC-51样激酶1（unc-51-like kinase 1，ULK1），AMPK-ULK1相互作用引起ULK1 磷酸化从而促进自噬［13-14］。Ⅱ型微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）作为自噬的标志性蛋白，是由LC3-I转化而来，定位于自噬体膜，故LC3-Ⅱ的蛋白水平可直接反映自噬体的数量［15］。P62 是选择性细胞自噬程序中的关键蛋白，其LIR 结构域可与LC3-Ⅱ结合形成复合物，从而削弱LC3-Ⅱ在自噬体中的作用，因此P62 的表达与细胞自噬活性呈负相关关系，起到指示自噬底物降解程度的作用［16-17］。自噬相关基因6（beclin1）是重要的肿瘤抑制蛋白，在ULK1作用下，beclin 1的Ser 14位点磷酸化从而激活PI3KⅢ复合物，进而对下游自噬体的形成起到重要作用［18-19］。

Figure 2.The expression changes of RXRα and the relative cell fluorescence of RXRα in all groups.The red arrow points to the nucleus，and yellow arrow points to RXRα.Mean±SD. n=5.▲▲P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs H/R group；**P＜0.01 vs DMSO group；△△P＜0.01 vs 9-RA group.图2 各组细胞RXRα的表达变化及荧光强度

RXR 是甾体激素受体超家族中的重要成员之一，其中又以RXRα 的研究最为广泛［4］。RXRα 存在多种组织器官中并参与了细胞的增殖、凋亡和分化等［20］。对于组织细胞的缺氧/复氧损伤，有研究证实激动RXR 可以减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤，其机制可能与抑制心肌细胞自噬有关［7］。因此，本研究通过运用RXR 激动剂9-RA 受体及RXR 拮抗剂HX531后，通过免疫荧光法检测各组细胞RXRα 的表达，观察RXR 激动剂和拮抗剂对细胞的干预效果。本研究免疫荧光结果显示，9-RA组的RXRα表达增多，而HX531 组细胞的 RXRα 表达显著减少，证实 RXR 激动剂和拮抗剂的确可以调整AEC Ⅱ中RXRα 的表达。

通过对AECⅡ进行缺氧/复氧、加用RXR 激动剂和拮抗剂等干预，CCK-8细胞活力检测显示，缺氧/复氧会引起细胞活力下降，而激动了RXR 后，细胞活力有所回升。各组细胞电镜观察结果也提示，除正常对照组外，其余各组细胞超微结构损伤加重，其中H/R、DMSO 和HX531 3 组细胞内可观察到自噬小体的出现；而9-RA 组相对来说细胞损伤减轻，未观察到明显的细胞自噬小体。RT-PCR 与Western blot 检测结果同样显示激动RXR 后细胞自噬得到一定程度抑制，而抑制RXR时细胞自噬水平上升。

Figure 3.Ultrastructure of the cells in each group under electron microscope.Yellow arrows point to mitochondria，blue arrows point to lamellar bodies，and red arrows point to autophagosomes.图3 各组细胞电镜超微结构

Figure 4.The mRNA expression of AMPK，beclin 1，LC3，mTOR and P62 in each group.Mean±SD. n=5.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs Con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 9-RA group.图4 各组细胞AMPK、beclin 1、LC3、mTOR和P62的mRNA表达

Figure 5.The protein levels of p-AMPK，beclin 1，LC3-Ⅱ，p-mTOR and P62 in all groups.Mean±SD. n=5.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs Con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 9-RA group.图5 各组细胞p-AMPK、beclin 1、LC3-Ⅱ、p-mTOR和P62的蛋白水平

综上所述，在本研究中通过对AEC Ⅱ进行缺氧/复氧处理并检测相关指标，可认为缺氧/复氧成功诱导了细胞自噬的高表达，加重了细胞损伤；而用9-RA 进行干预激活RXRα 能提高细胞活性，抑制细胞自噬，减轻缺氧/复氧引起的AEC Ⅱ损伤。提示RXR可能通过抑制细胞自噬，在缺氧/复氧对AECⅡ的损伤，这为在体的肺缺血再灌注损伤防治提供了一种新的药物干预靶点。