Clin-TOF-Ⅱ MS联合配套预处理试剂盒快速鉴定血培养阳性病原菌的研究*

2020-11-03姚冰洁肖晓光

国际检验医学杂志 2020年20期

姚冰洁，肖晓光，傅容，郭伟

(大连医科大学附属第一医院：1.检验科；2.医疗保险部；3.院内感染办公室，辽宁大连 116011)

血液、中枢神经系统、腹膜等无菌部位的感染患者病死率较高，预后差[1-4]。其中，血流感染的病死率为30%～50%[3]，及时、合理地使用抗菌药物对病原菌进行针对性的治疗对改善患者预后具有重要的作用。目前，传统培养法仍然是诊断血流感染的“金标准”，然而该方法耗时长，从血培养瓶报警到得到最终的鉴定结果需要16～48 h。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)能直接检测血培养阳性报警瓶中的病原菌，具有快速、准确等优点，已成为国内外研究的一大热点。与传统培养法比较，MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性报警瓶中病原菌有利于感染患者得到更早、更有效的治疗[5]。

临床基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统(Clin-TOF-ⅡMS)是我国自主研发的质谱仪，已通过国家食品药品监督管理局(SFDA)、美国食品药品监督管理局(FDA)认证，可用于临床病原微生物的鉴定[6-7]，已报道的血培养阳性报警瓶的前处理方法有很多，且阳性报警瓶的前处理过程对鉴定结果的准确性至关重要[8-9]。本研究采用Clin-TOF-Ⅱ MS联合配套预处理试剂盒(中国毅新博创)直接检测血培养阳性报警瓶中的病原菌，并对其鉴定符合率进行评估，以期为今后临床使用提供一定参考。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2019年1—5月本院血培养阳性报警标本254例(包括外周血标本156例，其他体液标本98例)，其中单一菌感染标本237例，混合菌感染标本(分离≥2种菌)17例。

1.2仪器与试剂血培养预处理试剂盒(中国毅新博创公司)，飞行时间质谱微生物标本处理试剂盒(中国毅新博创公司)，BACTEC FX全自动血培养仪(美国BD公司)，高速离心机(美国Thermo公司)，Clin-TOF-Ⅱ MS(中国毅新博创公司)，MicroScan®WalkAway 96 Plus全自动细菌鉴定/药敏分析仪(德国贝克曼库尔特公司)，BACTECTM血培养树脂需氧瓶、含溶血素厌氧瓶(美国BD公司)，API细菌鉴定系统(法国bioMerieux公司)。

1.3方法

1.3.1血培养阳性报警瓶中病原菌的富集与提纯使用飞行时间质谱微生物标本处理试剂盒富集与提纯血培养阳性报警瓶中的病原菌(裂解法)。第1步：从血培养阳性报警瓶中抽取标本200 μL转移到Eppendorf离心管，然后加入40 μL组分Ⅰ混匀，室温放置8 min；第2步：加入组分Ⅱ1 000 μL混匀后300×g离心3 min，取上清液转移至新的1.5 mL Eppendorf离心管中，13 000×g离心3 min沉淀细菌，弃上清液，然后再加入1 000 μL组分Ⅱ，洗涤后，13 000×g离心3 min，彻底去除上清液；第3步：加入40 μL组分Ⅲ，涡旋振荡30 s，静置5 min后，13 000×g离心1 min后备用。

1.3.2血培养阳性报警瓶中病原菌的Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定取2 μL处理后菌液点样至靶板的孔位上，室温干燥后覆盖2 μL基质液于样品上，室温干燥后使用Clin-TOF-Ⅱ MS进行检测，采集蛋白质指纹图谱，运用软件进行数据分析和比对，进行结果鉴定。根据产品说明，鉴定结果以置信度分数来判读：置信度≥25分，表示结果可信；置信度为20～<25分，表示该置信度下的鉴定结果需通过其他试验或者根据经验来选出最终鉴定结果；置信度<20分，表示该置信度下的鉴定结果不可靠。鉴定软件中每个数据会产生10个鉴定结果，以置信度分数最高且排名第一结果为准。

1.3.3血培养阳性报警瓶中病原菌的菌落鉴定血培养瓶阳性报警后，涂片革兰染色并且转种培养，培养24～48 h后，挑取纯菌落分别使用Clin-TOF-Ⅱ MS和MicroScan®WalkAway 96 Plus全自动细菌鉴定/药敏分析仪进行鉴定，若疑似为厌氧菌时，使用API细菌鉴定系统进行鉴定。当两种仪器鉴定结果不一致时采用API细菌鉴定系统进行确认。

1.4统计学处理使用SPSS22.0软件进行统计学分析。血培养阳性报警瓶Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定与菌落鉴定的鉴定分值的比较使用秩和检验(Mann-Whitney检验)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血培养阳性报警瓶单一菌感染标本Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定结果在237个单一菌感染标本中，Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定结果与菌落鉴定结果的符合率为86.5%(205/237)，其中革兰阳性菌的符合率为81.0%(94/116)，革兰阴性菌的符合率为93.9%(108/115)。具体结果见表1。

表1 单一菌感染标本Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定结果

续表1 单一菌感染标本Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定结果

2.2血培养阳性报警瓶Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定与菌落鉴定的鉴定分值血培养阳性报警瓶内细菌富集后使用Clin-TOF-Ⅱ MS进行直接鉴定，鉴定分值的P25、P50和P75为27、40和60。将血培养阳性瓶转种于血和巧克力平板或厌氧平板，恒温箱孵育，培养24～48 h后，挑取纯菌落使用Clin-TOF-Ⅱ MS鉴定，鉴定分值的P25、P50和P75为46、65和87。研究结果表明，转种培养后菌落鉴定的鉴定分值要高于直接鉴定，差异有统计学意义(Z=-8.571，P<0.001)。

2.3混合菌感染标本Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定结果 17例混合菌感染标本鉴定的符合率为17.6%(3/17)，有3例未鉴定出结果，其余11例混合菌感染标本均鉴定出其中一种结果。见表2。

表2 混合菌感染标本菌落鉴定结果及Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定结果

3 讨论

MALDI-TOF MS直接检测血培养阳性报警瓶中病原菌能够极大地缩短病原菌的鉴定时间[10-11]。近年来，国内外很多学者都对MALDI-TOF MS直接检测血培养阳性报警瓶中病原菌进行了探索，目前在我国临床上推广的主要有Biotyper MS和Vitek MS两大质谱系统，而这些研究也几乎都基于这两大质谱系统，目前将国产质谱系统用于血培养阳性报警瓶中病原菌直接检测的研究较少。随着MALDI-TOF MS逐渐在临床广泛应用，国产设备亦受到越来越多的关注。本研究使用我国自主研发的Clin-TOF-Ⅱ MS联合配套预处理试剂盒直接检测血培养阳性报警瓶中病原菌，评估其鉴定符合率。

本研究使用Clin-TOF-Ⅱ MS联合配套预处理试剂盒对单一菌感染标本的鉴定符合率较高，其中革兰阴性菌的鉴定符合率为93.9%(108/115)，革兰阳性菌的符合率为81.0%(94/116)，临床常见的革兰阴性菌、葡萄球菌属、肠球菌属的鉴定符合率均可达85%以上。李媛睿等[12]应用MALDI SepsityperTMKit联合MicroflexTMLT型质谱仪直接鉴定血培养标本，结果显示单种菌中革兰阴性菌的种、属水平符合率分别为75.4%(132/175)、77.7%(136/175)，革兰阳性菌的种、属水平符合率分别为70.9%(178/251)、74.9%(188/251)。段达荣等[13]使用VITEK MS质谱仪直接对血培养阳性标本细菌进行鉴定，结果显示单种菌中革兰阴性菌的种、属水平符合率分别为80.3%(114/142)、70.9%(83/117)。本研究结果提示，Clin-TOF-Ⅱ MS联合配套预处理试剂盒对阳性血培养报警瓶中病原菌的鉴定能力并不低于上述两大质谱系统。

有文献表明，MALDI-TOF MS对链球菌属、革兰阳性杆菌、念珠菌属及一些少见菌的鉴定符合率不高[14-15]，这与本研究结果一致。这可能由以下原因导致：(1)由于革兰阳性菌细胞壁结构相对较厚，不易裂解，或者由于细菌生长缓慢，菌体形态较小等，导致提取的核糖体蛋白浓度不够；(2)核糖体蛋白高度相似，特征性峰谱较少，质谱难以区分，比如肺炎链球菌、缓症链球菌和唾液链球菌等[16]；(3)某些标本中红细胞和白细胞的数量过多，使得在预处理过程中细胞裂解不充分，干扰了鉴定结果[12]。除此以外，Clin-TOF-Ⅱ MS本身的数据库并不完善也是影响其鉴定符合率的因素之一，可以通过不断完善数据库以及建立自建库等方法来提高其符合率。研究发现，Clin-TOF-Ⅱ MS直接鉴定血培养阳性报警瓶中病原菌的鉴定分值低于菌落鉴定结果，这可能是因为直接鉴定时血红蛋白的水平较高，在质谱检测时会产生强烈的信号及峰值从而对目的菌株的鉴定形成干扰[12]。

研究中还有17例混合菌感染标本，Clin-TOF-Ⅱ MS联合配套预处理试剂盒直接鉴定的符合率仅为17.6%(3/17)，有3例未鉴定出结果，其余11例混合菌感染标本均鉴定出其中一种结果。这说明虽然该方法具有简便、准确、快速等优点，但仍不能完全取代传统的培养法，因此，当血培养阳性报警瓶病原菌经过涂片、革兰染色确定为混合菌时，则应转种培养分纯后再进行鉴定，以免漏检阳性标本。