广东地区Hb New York患者血红蛋白电泳及血常规指标分析*

2020-11-03潘建华李艳红何高旺蔡秀仪

国际检验医学杂志 2020年20期

潘建华，张玲，李艳红，何高旺，蔡秀仪

(广州金域医学检验中心血液室，广东广州 510330)

血红蛋白病可分为两大类，一类是异常血红蛋白病，表现为血红蛋白珠蛋白肽链结构异常，如血红蛋白纽约(Hb New York)、HbE、HbG、HbQ、HbS等，据世界卫生组织的报告，全世界大约有1.5亿人携带异常血红蛋白病的基因[1]，该病是最为常见的一种单基因遗传病[2]。Hb New York是中国人群中一种常见的变异血红蛋白，属于β链变异，在第113位的β珠蛋白链上的氨基酸结构发生改变，谷氨酸取代缬氨酸。这种替换导致了α1和β1接触面除亚铁血红素组以外的区域面发生微妙变化，即致两者血红蛋白的电泳流动性和稳定性发生微小变化[3-6]。常见于复合珠蛋白生存障碍性贫血，严重者导致中度或重度贫血。另一类为珠蛋白生存障碍性贫血，是珠蛋白基因内部或其旁侧序列的突变，是珠蛋白肽链比例失衡所致的溶血性贫血[7]。相关分子生物学研究表明，无论是异常血红蛋白病，还是珠蛋白障碍性贫血，其分子基础相同，都是由于珠蛋白基因的突变所致[8]。近年来，血红蛋白病在我国发病率逐年升高，给社会与家庭带来了巨大的压力。目前，使用平均红细胞体积(MCV)[9]和红细胞渗透脆性试验(ROFT)[10-11]结果低于参考值进行血红蛋白病患者的初筛是较为常用的方法。因此，本文利用Hb New York血液学表型数据分析和寻找筛查Hb New York的快速方法，为疑似血红蛋白病患者诊断和治疗提供可靠的数据，同时也为预防珠蛋白生成障碍性贫血患儿的出生提供依据。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2014年3月至2018年12月在广州金域医学检验中心筛查血红蛋白病的体检、婚检、孕检的768 266例标本为病例组，其中男239 630例，女528 636例；年龄6～61岁，中位年龄28岁。选择100例在广州金域体检中心体检的健康者为对照组，男50例，女50例；中位年龄30岁；排除贫血或其他相关疾病。

1.2方法

1.2.1血常规分析收集EDTA-K2抗凝血2.0 mL，采用贝克曼COULTER LH750全自动血细胞分析仪作血常规分析[12]。ROFT采用广州米基公司生产的一管法，参考范围：ROFT结果<60%，MCV>80 fL，红细胞(RBC)为(3.5～5.5)×1012/L,平均红细胞血红蛋白量(MCH)为27～34 pg。血红蛋白A2(HbA2)参考范围为1.2%～3.5%。

1.2.2血红蛋白电泳分析收集EDTA-K2抗凝血2.0 mL，采用美国Helena公司全自动快速电泳系统(spife-3000)，在碱性(pH=8.6)条件下电泳，由于各种血红蛋白具有不同的等电点，可分离出各种血红蛋白区带，进行定性或定量检测各种血红蛋白区带。同时用美国PRIMUS公司CLC385TMSystem-高效液相色谱(HPLC)或法国Sebia Capillarys毛细管电泳仪进行验证。

1.2.3Thal基因检测 GAP-PCR检测3种常见的缺失型α-Thal基因(--SEA、-a3.7与-a4.2)，试剂由亚能公司提供，采用PCR结合反向点杂交法检测β-珠蛋白基因17个位点的18种突变，试剂由深圳益生堂生物公司提供。

1.2.4珠蛋白生成障碍性贫血判断标准根据《血液病诊断及疗效标准》[13]电泳法结果诊断α珠蛋白生成障碍性贫血时HbA2临界值为≤2.6%，镜检Heinz小体阳性；诊断β珠蛋白生成障碍性贫血时HbA2临界值为≥3.8%，以基因检测为“金标准”。

1.2.5异常血红蛋白判断标准当在电泳图谱中出现非“A”非“S”位置时，用毛细管电泳或HPLC法验证是快速或慢速带具体组别。Hb New York以基因蛋白测序为“金标准”。

1.2.6β-珠蛋白基因序列扩增与测序采用Primer premier 5.0软件设计扩增与测序，采用英俊公司的引物，基因扩增采用宝生物公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase酶反应体系，扩增产物使用加拿大Fermentas公司的试剂进行纯化，基因测序采用美国ABI公司的试剂与遗传分析仪进行分析。β-珠蛋白基因测序结果：杂合突变发生在β链上，基因突变型为1161C>T多态性，1371T>AT Hb New York(HBB∶C.341T>C)突变杂合子，所使用的引物序列以beta-323Fa为正向(F)上游扩增引物，其引物序列(5′-3′)为ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA；beta+30Rb为反向(R)下游扩增引物，其引物序列(5′-3′)为TGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTT；引物beta 507F，序列(5′-3′)TGGCTCACCTGGACAACC，与引物beta+30Rb，序列(5′-3′)TGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTT配对；引物beta 1091F，序列(5′-3′)TGTATCATGCCTCTTTGCA，与引物beta+30Rb，序列(5′-3′)TGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTT配对；引物beta-323Fa，序列(5′-3′)ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA，与引物beta 540R，序列CATTCGTCTGTTTCCCATT配对；引物beta-323Fa，序列(5′-3′)ATGCTTACCAAGCTGTGATTCCA，与引物beta 1088R，序列GCAAAGAGGCATGATACATT配对(注：a同时为上游扩增引物，b同时为下游扩增引物)。

1.3统计学处理采用SPSS18.0进行统计学分析。计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Hb New York检出情况 768 266例标本共检出966例Hb New York，Hb New York检出率为0.13%。Hb New York杂合子复合珠蛋白生成障碍性贫血检出率为9.1%(88/966)，其电泳浓度<40%，ROFT结果<60%，MCV<80 fL。43.8%(423/966)的Hb New York电泳浓度<40%，ROFT结果>60%，MCV>80 fL。Hb New York杂合子复合α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变的检出率为6.3%(61/966)。47.1%(455/966)Hb New York电泳浓度>40%，ROFT结果>60%、MCV>80 fL，基因检测结果显示，未检出α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变，为单纯Hb New York杂合子。

2.2血红蛋白电泳结果以MCV>80 fL、Hb New York电泳浓度>40%为A组，MCV<80 fL、Hb New York电泳浓度<40%为B组，MCV>80 fL、Hb New York电泳浓度<40%为C组。3组HbA2、Hb New York电泳浓度差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。Hb New York采用毛细管电泳法进行验证的结果显示，电泳结果未见异常。其碱性电泳结果见图1。

表1 血红蛋白电泳结果

注：1、3均为正常标本，2为异常血红蛋白。图1 Hb New York碱性电泳图

2.3ROFT结果 A组ROFT结果(92.85%±9.08%)与对照组(93.91%±11.35%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)；B组ROFT结果(45.0%±17.21%)与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；C组ROFT结果(81.56%±13.86%)与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。A组与B组比较，两组ROFT结果差异有统计学意义(P<0.05)；A组与C组比较，两组ROFT结果差异有统计学意义(P<0.05)；B组与C组比较，两组ROFT结果差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4A、B、C组与对照组RBC、血红蛋白、MCV、MCH的比较 4组间RBC、血红蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。B组MCV、MCH明显低于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)；A、C组和对照组间MCV、MCH比较，差异无统计学意义(P>0.05)；见表2。

表2 A、B、C组与对照组RBC、血红蛋白、MCV、MCH的比较

2.5Hb New York不同浓度复合珠蛋白生成障碍性贫血基因类型的检出情况结果显示，A组为单纯Hb New York杂合子，未检出α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失或β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变；B组Hb New York杂合子复合α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失12例，复合β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变76例；C组Hb New York杂合子复合α珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失22例，复合β珠蛋白生成障碍性贫血基因突变39例。见表3。

表3 Hb New York杂合子复合珠蛋白生成障碍性贫血基因检测结果[n(%)]

3 讨论

本研究结果显示，广东地区Hb New York检出率为0.13%，与温应方等[14]报道的结果差异较大，与李友琼等[15]结果相近，可能与标本来源不同有关。Hb New York在电泳图谱上属于K组，突变发生于α1和β1接触面，属于轻度不稳定蛋白，大多数Hb New York基因携带者无明显临床症状。关于Hb New York的起源，较多研究者认为起源于客家人[16-18]。本研究是建立在血液学表型和基因型分析结果一致的情况下进行的，可以进一步地了解广东地区Hb New York起源。结果显示，经碱性血红蛋白电泳筛查出的异常Hb New York共966例，经测序证实与血红蛋白电泳完全符合，且均为Hb New York(HBB∶C.314T>C)突变杂合子，其中817例为单纯Hb New York突变杂合子，患者血液学检测指标基本无变化，只有在电泳时在HbA上方出现Hb New York。本研究中的B组患者即Hb New York杂合子复合珠蛋白生成障碍性贫血患者，均有不同程度的贫血症状表现，MCV、MCH、ROFT明显降低，同时还可见Hb New York的浓度也降低，但RBC、血红蛋白及HbA2结果均在参考范围内，无明显血液学表现。

Hb New York患者血常规指标(RBC、血红蛋白、MCV、MCH)正常或偏低，外周血涂片显示中度小红细胞症，临床易被诊断为缺铁性贫血。当琼脂糖碱性(pH=8.6)电泳图在紧邻HbA上方出现非“A”位置异常血红蛋白时，有必要用另外一种酸性电泳方法(pH=6.5)或HPLC、毛细管电泳去验证排除该变异为Hb New York的可能性。若存在，则Hb New York从HbA分离向阳极移动，而HPLC不能很好地将其分开，因为在HPLC中，Hb New York和HbA的保留时间几乎一致。因此，筛查Hb New York或排除Hb New York复合珠蛋白生成障碍性贫血时，可通过Hb New York在碱性和酸性琼脂凝胶电泳中的相对移动速度初步验证发现的异常Hb New York，试验条件充足时可以用蛋白测序的方法确证。但杂合子的Hb New York患者通常情况无临床症状，不会致病，因此，若排除珠蛋白生成障碍性贫血的夫妻双方，可以不用再做下一步的测序，减轻了患者经济负担。反之，需要排除Hb New York复合珠蛋白生成障碍性贫血的可能性，避免夫妻同型生育重型珠蛋白生成障碍性贫血儿的风险，可为临床提供可靠的诊断依据。

而糖化血红蛋白(HbA1c)的测定会受到变异血红蛋白的干扰，使HbA水平下降，从而导致HbA1c的结果受到干扰，且变异血红蛋白也会被糖化，因此，如果患者检测出异常血红蛋白时，需把正常的HbA1c与变异血红蛋白糖化的部分相加才为HbA1c结果[19]。另有文献报道，血小板计数也会因为异常血红蛋白受到干扰[20]。因此，在血红蛋白病高发的地区，建议采用ROFT、红细胞参数检测、碱性血红蛋白电泳进行联合初筛，同时对筛查出的异常血红蛋白进行验证以示区别。本文对部分Hb New York基因测序进行确诊Hb New York基因突变杂合子，符合率达100%。可见，血红蛋白电泳联合ROFT及血常规检测可作为筛查Hb New York的一种较好且快速、简便的方法。