管花肉苁蓉中酶法转化毛蕊花糖苷
2020-11-02柏伟荣杨绪芳张理兴高如意吴云
柏伟荣*,杨绪芳,张理兴,高如意,吴云
江苏康缘药业股份有限公司(连云港 222001)
《中国药典》2015年版收载的肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉和管花肉苁蓉(Cistɑnche tubulosɑ(Schrenk)Wight)的肉质茎,是名贵的补益药材。其中苯乙醇苷类物质为肉苁蓉中主要活性成分,有学者已经证实该类成分具有明显的抗老年痴呆、帕金斯病和心肌缺血等作用[1-2]。管花肉苁蓉的苯乙醇苷成分较其他肉苁蓉属植物含量高,其中以松果菊苷和毛蕊花糖苷最多。研究表明毛蕊花糖苷具有抗氧化、抗炎、降血糖及血脂的药理功效[3-5],但是该成分与松果菊苷相比在管花肉苁蓉中含量偏低,这也导致了提取分离研究主要集中在松果菊苷,较少涉及毛蕊花糖苷[6]。随着生物科技的发展,酶作为催化剂在中药领域的应用越来越多[7],此次试验研究了利用一种来源于热袍菌(Thermotogɑ petrophilɑDSM 13995)的β-葡萄糖苷酶,通过对肉苁蓉提取物的酶解,使得松果菊苷转化为毛蕊花糖苷来富集制备毛蕊花糖苷。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
管花肉苁蓉饮片(新疆和田天力沙生药物开发有限责任公司);β-葡萄糖苷酶[8](南京林业大学赵林果教授实验室提供)由极端热袍菌(Thermotogɑ petrophilɑDSM 13995)中β-葡萄糖苷酶基因(Tpebgl3)克隆转化到大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌表达得到;松果菊苷(自制,纯度>97.4%,采用HPLC测定);毛蕊花糖苷(批号:11530-201713,92.5%,中国食品药品检定研究院);95%乙醇(食用级,连云港长和酒业有限公司);甲醇为色谱纯(美国天地公司);其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
IKA磁力搅拌器;pH计(Mettler-Toledo FE20);Agilent1100高效液相色谱仪;EYELA旋转蒸发仪;Burker-AV-400型核磁共振波谱仪;AE240电子分析天平(瑞士 Mettler公司)。
2 方法
2.1 松果菊苷酶解率的测定
2.1.1 色谱条件[9]
Waters C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相A为甲醇,流动相B为0.1%甲酸溶液;梯度洗脱(0~15 min,18%~28% A;15~30 min,28%~32%A;30~40 min,32% A;40~50 min,32%~50% A);柱温30 ℃;流速1 mL·min-1;检测波长330 nm。
2.1.2 线性关系的考察
精密称取5.0 mg毛蕊花糖苷对照品置于25 mL容量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,精密吸取0.2,0.5,1.0,2.0和3.0 mL该溶液,分别置于10 mL容量瓶中,配制成质量浓度3.7,9.25,18.5,37和55.5 μg/mL的毛蕊花糖苷溶液,在2.1.1小节色谱条件下精密吸取10 μL注入色谱仪进行测定,以对照品浓度为横坐标,以峰面积分值为纵坐标,回归方程为Y=18 245.572+3 325 654.092X,R=0.999 9。
2.1.3 酶解率的测定
准确称取1 g松果菊苷,置于500 mL三角瓶中,平行制备2份样品,加入到399.8 mL缓冲溶液(用醋酸钠和0.5 mol·L-1的醋酸配制,pH 5.5)中,搅拌均匀,水浴加热至85 ℃时再加入0.2 mLβ-葡萄糖苷酶溶液,反应4 h后,加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液终止反应,将反应终止的酶解液补至400 mL,取1 mL稀释100倍,在2.1.1小节的色谱条件下精密吸取10 μL注入色谱仪进行测定,根据式(1)计算酶解率:
式中:C为毛蕊花糖苷浓度,μg·mL-1;Me为松果菊苷相对分子量,g;Mg为毛蕊花糖苷相对分子质量。
2.1.4 毛蕊花糖苷的纯化
反应液冷却后,通过AB-8树脂富集,95%乙醇洗脱后浓缩干燥,得到高纯度的毛蕊花糖苷,按2.1.1小节的色谱条件采用归一化法测定毛蕊花糖苷的纯度。
2.1.5 温度对酶解率的影响
称取6份1.0 g的松果菊苷于6个500 mL三角瓶中,各加入399.8 mL pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,然后各加0.2 mL酶,分别在70,75,80,85,90和95 ℃下反应4 h,然后加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液终止反应。按2.1.3小节测定酶解率。
2.1.6 pH对酶解率的影响
称取6份1.0 g的松果菊苷于6个500 mL三角瓶中,各加入399.8 mL pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0和6.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,然后各加0.2 mL酶,分别在85℃下反应4 h,之后再加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液终止反应。按2.1.3小节测定酶解率。
2.1.7 加酶量对酶解率的影响
称取6份1.0 g的松果菊苷分别于6个500 mL三角瓶中,各加入400,399.95,399.9,399.8,399.6和399.0 mL pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,再分别加入0,0.05,0.1,0.2,0.4和1.0 mL酶液,于85 ℃酶解4 h,加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液终止反应。按2.1.3小节测定酶解率。
2.1.8 酶解时间对酶解率的影响
称取6份1.0 g的松果菊苷于6个500 mL三角瓶中,各加入399.8 mL pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,然后各加0.2 mL酶,于85 ℃分别酶解0.5,1,2,3,4和6 h,加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液终止反应。按2.1.3小节测定酶解率。
2.2 毛蕊花糖苷的结构鉴定
使用Burker生产的AV-400型核磁共振波谱仪,采用核磁共振氢谱(1H-NMR)法和核磁共振碳谱(13C-NMR)法鉴定毛蕊花糖苷结构。
2.3 利用酶转化管花肉苁蓉提取物
管花肉苁蓉提取物,为管花肉苁蓉经过水提,水提液再经过AB-8大孔树脂富集所得到的提取物。称取2.5 g肉苁蓉提取物,加入到399.8 mL缓冲溶液(用醋酸钠和0.5 mol·L-1的醋酸配制,pH 5.5)中,搅拌均匀,水浴加热至85 ℃时再加入0.2 mLβ-葡萄糖苷酶溶液,反应4 h,加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液终止反应。按2.1.1小节色谱条件进行含量测定。
反应液冷却后,通过AB-8树脂富集,95%乙醇洗脱后浓缩干燥,得到高纯度的毛蕊花糖苷,按2.1.1小节的色谱条件采用归一化法测定毛蕊花糖苷的纯度。
3 结果与讨论
3.1 松果菊苷酶解率的测定结果
图1 松果菊苷和毛蕊花糖苷的HPLC图
通过HPLC对酶解得到的毛蕊花糖苷进行检测,酶解率为95.6%;经过分离纯化,测得毛蕊花糖苷样品纯度在96%以上,结果如图1所示。
3.2 温度对酶解率的影响
因为酶是蛋白质,高温会使蛋白质变性失去活性,所以高温会影响酶的作用和活性,低温也会抑制酶活性。由图2可知,当温度为85 ℃时酶解率最高,即β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为85 ℃。
图2 温度对酶解率的影响
3.3 pH对酶解率的影响
过酸、过碱能使酶本身变性失活,因此有必要考察缓冲液pH对酶解率的影响。由图3可知,当pH为5.5时,酶解率最高;当pH低于或高于5.5时,酶活性明显降低。即β-葡萄糖苷酶的最适反应pH为5.5。
图3 pH对酶解率的影响
3.4 加酶量对酶解率的影响
考察加酶量对酶解率的影响,以加酶量为横坐标,酶解率为纵坐标作图,加酶量对酶解率的影响见图4。在较低的酶浓度下,随着β-葡萄糖苷酶酶量的增加,松果菊苷的酶解率逐渐增加,当加酶量达到0.2 mL时增长的趋势变缓,所以当底物松果菊苷为1 g时,最适加酶量为0.2 mL。
3.5 酶解时间对酶解率的影响
当加酶量为m(松果菊苷)︰V(酶液)=1 g︰0.2 mL时,考察最适酶解时间。由图5可知,4 h时酶解率为95%,几乎完全酶解;4 h后基本完全反应,酶解率增加得非常缓慢。所以,当加酶量为m(松果菊苷)︰V(酶液)=1︰0.2(g/mL),pH为5.5,温度为85 ℃时,最适酶解时间为4 h。
综上所述,利用耐热β-葡萄糖苷酶酶解松果菊苷转化为毛蕊花糖苷的最适反应条件为:每克松果菊苷加入0.2 mL的酶液,温度85 ℃,pH 5.5,反应时间4 h。
图4 加酶量对酶解率的影响
图5 酶解时间对酶解率的影响
3.6 酶解得到的毛蕊花糖苷的结构鉴定
利用核磁共振波谱对酶解产物进行结构检测。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.06(1H,d,J=1.8 Hz),6.96(1H,dd,J=1.8 Hz,8.0 Hz),6.78(1H,d,J=8.0 Hz),6.70(1H,d,J=1.8 Hz),6.68(1H,d,J=8.0 Hz),6.57(1H,dd,J=1.8 Hz,8.0 Hz),7.60(1H,d,J=16.0 Hz),6.28(1H,d,J=16.0 Hz),5.19(1H,d,J=0.7 Hz),4.37(1H,d,J=8.0 Hz),2.79(1H,t)。13C-NMR(101 MHz,CD3OD)δ:167.04,148.37,146.73,145.39,144.68,143.23,130.17,126.30,121.97,120.01,115.84,115.25,115.05,113.97,113.34,102.75,101.66,80.38,74.78,74.54,72.42,70.96,70.90,70.68,69.21,69.07,60.97,57.04,35.15,17.14。以上数据与文献[10-11]报道的毛蕊花糖苷一致,故确定酶解所得化合物为毛蕊花糖苷。
3.7 酶水解管花肉苁蓉提取物的测定结果
利用2.1.1小节的液相方法,通过HPLC对管花肉苁蓉提取物进行检测。经检测,肉苁蓉提取物中松果菊苷含量占38.7%,毛蕊花糖苷含量仅为1.9%,毛蕊花糖苷的含量在管花肉苁蓉提取物中含量偏低。
利用该酶对管花肉苁蓉提取物进行酶解,以富集制备毛蕊花糖苷。通过液相检测反应液的松果菊苷以及毛蕊花糖苷的含量,结果显示4 h后,松果菊苷全部转化为毛蕊花糖苷,含量约32.1%;取反应终止液进行纯化,得到0.48 g毛蕊花糖苷样品,毛蕊花糖苷含量为64.3%。
图6 管花肉苁蓉提取物(上)及酶解液(下)的HPLC图
4 讨论与结论
管花肉苁蓉的主要活性成分是以松果菊苷和毛蕊花糖苷为代表的苯乙醇苷类物质,研究发现毛蕊花糖苷具有消炎、抗氧化、降低Ⅱ型糖尿病小鼠血糖血脂等药理功效[3,5,12-15];还有研究表明毛蕊花糖苷具有雄性激素的作用,为肉苁蓉补肾壮阳的重要活性成分[16]。但是管花肉苁蓉中毛蕊花糖苷的含量偏低,此次试验利用转基因技术得到的一种耐热的β-葡萄糖苷酶,通过转化肉苁蓉提取物中的松果菊苷,使其转化为毛蕊花糖苷,极大地提高了毛蕊花糖苷的含量。该酶催化松果菊苷水解的最适反应温度为85 ℃,最适pH为5.5,当2.5 g肉苁蓉提取物加0.2 mL酶液时,反应4 h,松果菊苷基本完全转化为毛蕊花糖苷。由于管花肉苁蓉提取物中还有很多含有β-葡萄糖结构的化合物比如管花苷A、B、C等,因此管花肉苁蓉提取液通过该酶反应后,不仅松果菊苷转化为毛蕊花糖苷,还有其他成分一同转化,进一步研究可以考虑研究酶解后肉苁蓉的化学成分。
因为β-葡萄糖苷酶具有极耐热性,在后续工业化生产中,管花肉苁蓉提取后,提取液未经冷却可直接加入酶水解转化,操作简单便捷,易于工业化生产,有良好的应用前景。