不同温度、pH、光照条件下毛蕊花苷的降解动力学

张阿惜,连英竹,沈月峰,付桂明,3,万 茵,*

(1.南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,食品学院,江西南昌 330047; 2.南昌大学食品学院,江西南昌 330031; 3.南昌大学中德食品工程中心,江西南昌 330047)

毛蕊花苷作为天然化合物主要分布在车前子、玄参和肉苁蓉等双子叶植物中,属于典型的苯乙醇苷类物质[1]。毛蕊花苷的结构由四个单元组成,其中咖啡酸和4,5-二羟基苯乙醇(羟基酪醇)以及鼠李糖单元分别通过酯键和糖苷键连接到中心葡萄糖上。近年来发现毛蕊花苷具有良好的抗氧化[2]、抗炎[3]、保肝[4]、抗菌[3]、抗癌[5]、降血压[6]、抗肿瘤[7]及改善神经细胞凋零[8]等多种生理活性,说明毛蕊花苷在天然药物和保健品研发领域具有广阔的应用前景[9-11]。但是,毛蕊花苷的结构易发生变化,一定程度上限制了它的开发利用。如Vertuani等[7]研究发现毛蕊花苷在弱酸性环境下(pH5)放置60 d后稳定性较好,回收率为73%,pH6时毛蕊花苷的稳定性居中,回收率为10%左右,而在中性环境(pH7)室温保存3周已基本降解完全。Zhou等[12]发现高温、碱性及光照条件下储存的毛蕊花苷异构化成了异毛蕊花苷。然而有文献表明异毛蕊花苷在降尿酸方面效果不及毛蕊花苷。曾金祥等[13]研究结果表明,异毛蕊花苷有一定降尿酸作用,但降尿酸能力远小于毛蕊花苷,其对黄嘌呤氧化酶亦无显著抑制作用。因此,保证毛蕊花苷的稳定性且防止其发生转化对于毛蕊花苷的应用具有至关重要的意义。目前关于毛蕊花苷稳定性的研究大多只是监测其在不同环境下的含量变化,关于毛蕊花苷的降解动力学仅有个别报道[12],且其选择考察的水平点范围较小,如未研究常用的加工温度60和100 ℃;未发现有关于车前子来源的毛蕊花苷降解动力学的研究。

毛蕊花苷分布广泛且药用价值高,但其在不同温度、pH、光照条件下的不稳定性,严重影响其含量测定、消化吸收、体内外活性等研究结果的准确性和实用性,因此本文研究并建立了其在不同温度、pH、光照条件下各自的降解半衰期和降解动力学方法,分析了降解过程中各参数的变化规律,并推导了其热降解动力学方程,且建立了热降解动力学模型,以期为有效控制毛蕊花苷的降解提供理论依据,从而为进一步确保毛蕊花苷的稳定性使其更加广泛地应用到天然保健品开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛蕊花苷(液相纯度98.8%) 本实验室利用柱层析、制备液相色谱技术从车前子中提取分离获得[14];甲醇(色谱级) Honeywell公司;蒸馏水 屈臣氏公司。

Waters e2695高效液相色谱仪 Waters公司;FA1604精密电子天平 上海精密科学仪器有限公司;DKS-24型不锈钢新型电热恒温水浴锅 嘉兴市中新医疗仪器有限公司;SevenEasyS20台式pH酸度计 上海梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC测定条件 Waters e2695型高效液相色谱仪;色谱柱:Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);检测器:2998 PDA二极管阵列检测器;检测波长:330 nm;流速0.6 mL/min;进样量:10 μL;流动相:甲醇(A):0.1%甲酸水溶液(B),比例为40∶60;柱温35 ℃。

1.2.2 毛蕊花苷的降解动力学研究

1.2.2.1 光照、避光下毛蕊花苷的降解动力学研究 参照Zhou等[12]研究方法,配制浓度为30 μg/mL的毛蕊花苷对照品溶液。分别取14份毛蕊花苷对照品溶液10 mL于试管中,室温(20 ℃)下分别置于光照和暗箱环境中,间隔0、1、2、3、4、5、6 d取样,HPLC测定其含量,并确定反应级数,计算降解半衰期。

1.2.2.2 不同温度下毛蕊花苷的降解动力学研究 参照Zhou等[12]研究方法,为了考察毛蕊花苷在人体正常温度、旋蒸浓缩温度、超声提取温度、水溶液沸腾温度下的稳定性,分别取5份毛蕊花苷对照品溶液10 mL于试管中,于避光条件下分别置于37、50、60、80、100 ℃的恒温水浴锅中,在37和50 ℃下间隔0、24、48、72、96、120 h,在60和80 ℃下间隔0、1、2、3、4、5 h,在100 ℃下间隔0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,取样,迅速降至室温后,以未作处理的毛蕊花苷对照品溶液作空白,于HPLC测定条件下测定其含量,确定反应级数,计算降解半衰期。

1.2.2.3 不同pH条件下毛蕊花苷的降解动力学研究 为了考察毛蕊花苷在强酸性、弱酸性、中性、弱碱性条件下的稳定性,本文研究了毛蕊花苷在pH2、6、7、8条件下的降解动力学。称取一定量的毛蕊花苷加入到用盐酸或氢氧化钠配制pH分别为2、6、7、8的水溶液中,并将该溶液中毛蕊花苷终浓度调整至30 μg/mL,摇匀,于避光、37 ℃条件下放置。分别于样品制备后0、2、4、6、8、10 h取样,以未作处理的毛蕊花苷对照品溶液作对照。于HPLC测定条件下测定其含量,确定反应级数,计算降解半衰期。

1.2.3 反应级数的确定 参照文献[15-16]测定。利用零级、一级和二级动力学公式计算毛蕊花苷的降解速率,然后进行线性回归分析,比较决定系数,零级动力学方程如式(1)所示:

C-C0=-Kt

式(1)

一级动力学方程如式(2)所示:

-ln(C/C0)=Kt

式(2)

二级动力学方程如式(3)所示:

式(3)

式中:C为在处理t时间后的毛蕊花苷浓度,μg/mL;C0为毛蕊花苷起始浓度,μg/mL;K为一级反应速率常数,h-1;t为处理时间,h。

1.2.4 降解动力学模型的确定 参照文献[16-18]测定。表观活化能Ea和K0可以从一级反应速率常数的对数(lnK)对热力学温度的倒数(1/T)的作图中求出:现假设毛蕊花苷的降解符合Arrhenius方程如式(4)所示。

式(4)

则可预测动力学模型如式(5)所示。

式(5)

式中:t为从C到C0所需时间,h;K为一级反应速率常数,h-1;K0为频率常数,h-1;Ea为表观活化能,kJ/mol;R为摩尔气体常数,8.314J/(mol·K);T为开尔文温度,K。

1.2.5 半衰期的计算 参照文献[19-21]测定,半衰期计算方程如式(6)所示。

T1/2=-ln0.5×(1/K)

式(6)

式中:T1/2为半衰期(毛蕊花苷保存率为50%的时间),K为一级反应速率常数。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素ANOVA方差分析(P<0.05),并用Origin 9.0作图,以上所有实验重复三次。

表2 温度与毛蕊花苷降解速率的关系Table 2 Relationship between temperatures and degradation rates of verbascoside

2 结果与分析

2.1 光照/避光条件下毛蕊花苷的降解动力学

2.1.1 反应级数的确定 光照/避光条件下毛蕊花苷的降解动力学中反应级数研究结果如图1所示。由图1可知,毛蕊花苷-ln(C/C0)与t的关系函数斜率即黑暗条件下的反应速率常数明显要比光照条件下小,说明在长时间内,避光对毛蕊花苷的保护作用很好。Zhou等[12]研究发现在避光和光照条件下毛蕊花苷标准品的反应速率常数分别为0.0054和0.0124 day-1,光照条件下毛蕊花苷会转变成咖啡酸单元和羟基酪醇单元,并异构化为异毛蕊花苷。光照和避光下毛蕊花苷的线性决定系数都接近1,可见,相关性很好,即-ln(C/C0)与t呈线性关系,降解反应属于一级反应。

图1 光照和避光下毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图Fig.1 Changes of-ln(C/C0)with timefor verbascoside in the dark and light注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05),图2、图4同。

2.1.2 降解半衰期的确定 由于前期的实验研究结果以及Zhou等[12]研究中,均表明20 ℃下,毛蕊花苷较稳定。本文此处主要观察在体温、加工温度下的稳定性。在光照和避光条件下的降解半衰期如表1所示。由表1可以看出,毛蕊花苷在光照和避光时的半衰期均低于Zhou等[12]的数据,可能原因是Zhou等研究的对象为从桂花中提取得到的毛蕊花苷,且其研究的试验条件为pH6,与本文研究的毛蕊花苷来源和pH条件不同。避光条件下,毛蕊花苷半衰期为295.0 h,光照下毛蕊花苷的反应速率常数大约是避光下的1.5倍,半衰期大约是避光下的3/5,说明避光下的毛蕊花苷稳定性较好,易于保存,这与Zhou等[12]的研究结果相吻合,因此,本文后续实验均采用避光处理。

表1 光照和避光下毛蕊花苷的降解半衰期Table 1 Half-life time values ofverbascoside in the dark and light

2.2 不同温度下毛蕊花苷的降解动力学研究

2.2.1 反应级数的确定 不同温度下毛蕊花苷的降解动力学中反应级数的研究结果如图2所示。由图2A和2B可知,毛蕊花苷在37和50 ℃恒温水浴中,随着时间的增加,降解速率较为缓慢,尤其是在37 ℃条件下。由图2C可知,毛蕊花苷在60～100 ℃高温水浴中-ln(C/C0)与t的一次函数斜率增大,即反应速率常数K增大,说明即使在避光条件下,毛蕊花苷在高温也非常不稳定。毛蕊花苷在100 ℃的水浴中孵育2.5 h后降解率为82.53%,可见,温度越高,对毛蕊花苷的破坏性越大,而在37 ℃下孵育120 h后降解率为24.90%,说明加热时间越长,对毛蕊花苷的降解率越高。Wong等[22]也发现将161 μg/mL毛蕊花苷置于暗处煮沸(100 ℃)8 h,约80%毛蕊花苷会转变为异毛蕊花苷。从图2A和2B可知,毛蕊花苷在37、50 ℃恒温水浴中,在20 h内,随着时间的增加,含量基本不会减小。图2中,在37、50、60、80、100 ℃下,毛蕊花苷的线性决定系数R2均接近1,即-ln(C/C0)与t呈线性关系,降解反应属于一级反应。

图2 不同温度条件下毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图Fig.2 Changes of-ln(C/C0)with time for verbascoside at different temperatures注:A为37 ℃时毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图;B为50 ℃时毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图;C为60 ℃时毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图;D为80 ℃时毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图;E为100 ℃时毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图。

2.2.2 分析降解动力学模型 由预测模型可知,只须求出K0和Ea,就可建立起毛蕊花苷的降解模型。由lnK=-Ea/RT+lnK0可知,以1/T为横坐标,以lnK为纵坐标作线性方程,斜率为-Ea/R,截距为lnK0,结果如表2和图3所示。

图3 毛蕊花苷降解速率与温度的关系图Fig.3 Arrhenius plot of verbascoside

2.2.3 降解半衰期的确定 各个温度下的降解半衰期如表3所示。由表3可知,随着温度的升高,反应速率常数K增大,半衰期t1/2减小,说明毛蕊花苷的降解速率随温度的升高而加快。由毛蕊花苷的半衰期变化可以知道,毛蕊花苷不耐热,低温有助于延长毛蕊花苷的保存期,37 ℃下半衰期为288.8 h。Zhou等[12]也提出毛蕊花苷的半衰期随温度的升高而下降。所以毛蕊花苷适宜在低温下贮存。

表3 不同温度下毛蕊花苷的降解半衰期Table 3 Half-life time valuesof verbascoside at different temperatures

2.3 不同pH环境下毛蕊花苷的降解动力学研究

2.3.1 反应级数的确定 由图4可知,pH2、6、7、8中毛蕊花苷的-ln(C/C0)与t的一次函数图像斜率相差较大,即pH2、6、7、8中毛蕊花苷的反应速率常数K呈递增关系。说明在低pH、中性、碱性环境中毛蕊花苷的稳定性相差较大。pH2中毛蕊花苷的-ln(C/C0)与t的一次函数斜率即反应速率常数K明显小于pH6、7、8,说明在低pH中,毛蕊花苷的稳定性较好。且pH2、6、7、8中毛蕊花苷-ln(C/C0)与t的线性决定系数均接近1,可见相关性很好,降解反应属于一级反应[12]。

图4 不同pH条件下毛蕊花苷-ln(C/C0)与t关系图Fig.4 Changes of-ln(C/C0)with time for verbascoside at different pH values

2.3.2 降解半衰期的确定 各个pH下的降解半衰期如表4所示。由表4可以看出,在pH2、6、7、8下,除了pH2之外三种pH条件下毛蕊花苷的反应速率常数较大,半衰期较短,pH2条件下毛蕊花苷较稳定,变化不大,半衰期较长(74.5 h),说明低pH对毛蕊花苷影响不大,因此毛蕊花苷适合在低pH条件下保存[23-25],D’Imperio等[2]也证明了这个结论,指出毛蕊花苷在pH3环境下稳定性大于pH7,24 h后回收率几乎100%,而在中性环境中毛蕊花苷回收率为62.4%,且异构化为异毛蕊花苷。毛蕊花苷的分子结构中存在邻二酚羟基和糖苷键,在中性或碱性情况下久置易发生氧化分解[26],Zhou等[12]研究发现在pH5～7时,毛蕊花苷的主要降解产物为咖啡酸、羟基酪醇和异毛蕊花苷。

表4 不同pH下毛蕊花苷的降解半衰期Table 4 Half-life time values ofverbascoside at different pH values

3 结论

研究表明在不同温度、pH、光照和避光条件下,毛蕊花苷的降解反应均属于一级反应。通过对毛蕊花苷在这三种条件下降解动力学的研究,从而可以预测不同条件下三者的降解时间。目前,结果表明低温、低pH及避光条件对毛蕊花苷的保护作用明显。光照下毛蕊花苷的反应速率常数大约是避光下的1.5倍,半衰期大约是避光下的3/5,说明避光下的毛蕊花苷稳定性较好,易于保存。避光、37 ℃、pH2条件下毛蕊花苷较稳定,半衰期明显延长。本文深入探讨影响毛蕊花苷稳定性的因素及对其进行分析,为车前子、玄参和肉苁蓉等富含毛蕊花苷的天然保健食品资源植物的加工工艺参数的优化及毛蕊花苷提取、纯化过程和其在机体胃肠道中的稳定性提供了理论依据。