碱法提取玉米胚芽蛋白的条件优化
2020-11-02高泽汝刘昆仑陈复生
高泽汝，刘昆仑*，陈复生
河南工业大学粮油食品学院（郑州 450001）
玉米是我国重要的粮食作物，2018年我国玉米总产量达25 717万 t，位于粮食作物首位。玉米胚芽是玉米籽粒的生命之源，富含优质的蛋白质、脂肪、维生素以及人体所需的生理活性物质，营养价值极高[1]。目前，玉米胚芽主要用作制油原料，副产物胚芽粕由于常作为饲料处理，不仅生产效益较低，同时造成优质蛋白资源的极大浪费[2]。
玉米胚芽蛋白中含有人体所需的全部必需氨基酸[3]，具有较高的生物价（BV），仅次于鸡蛋（94%）和牛奶（85%）[4]，其蛋白质功效比值（PER）高达2.56，与大豆蛋白（2.32）、酪蛋白（2.5）媲美[5]。玉米胚芽蛋白中以清蛋白和球蛋白含量为主，还有少量的谷蛋白和胶蛋白[6]。同时玉米胚芽蛋白具有优越的功能性质，如吸油、起泡、延展、乳化、持水能力、凝胶作用等，在食品工业生产中，是一种非常理想的蛋白质配料，具有广阔的开发及应用前景[7]。
此次试验以玉米胚芽为原料，碱法提取玉米胚芽蛋白，探究料液比、温度、碱溶时间、pH对蛋白提取的影响。采用响应面法优化提取工艺条件，确定最佳提取工艺，为玉米胚芽蛋白的提取提供借鉴，同时为玉米胚芽蛋白质资源的精深加工提供理论基础和试验参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米胚芽（脱脂后蛋白含量为25%，山东三星玉米产业科技有限公司）；正己烷（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）；硫酸、盐酸（洛阳昊华化学试剂有限公司）。
1.2 仪器与设备
ST-07B多功能粉碎机（上海树立仪器仪表有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；TDL-5-A型台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；LGJ-25E冷冻干燥机（四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司）；K1100全自动凯式定氮仪（山东海能科学仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 样品预处理
对玉米胚芽进行初步筛选，然后使用万能粉碎机粉碎，按料液比1︰8（g/mL）加入正己烷，振荡脱脂，重复3次，置于通风橱晾干，过60目筛，于-20℃干燥避光处密封保存，备用。
1.3.2 玉米胚芽原料成分的测定
水分含量的测定参照GB 5009.3—2016；灰分含量的测定参照GB 5009.4—2016；底物总蛋白质含量的测定参照GB/T 5009.5—2016；脂肪含量的测定参照GB/T 5009.6—2016。
1.3.3 玉米胚芽蛋白提取工艺流程
取30 g玉米胚芽脱脂粉于烧杯中，以料液比1︰15（g/mL）加入去离子水，用1 mol/L NaOH调节溶液pH至9.5，在50 ℃恒温水浴锅中连续搅拌120 min，以4 000 r/min离心20 min，取上清液，用1 mol/L HCl调节pH至4.8，静置30 min后，以5 000 r/min离心15 min，弃去上清液，将沉淀水洗至中性，冷冻干燥，即得到玉米胚芽蛋白。
1.3.4 单因素试验
选择料液比（1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30 g/mL）、温度（40，45，50，55和60 ℃）、pH（7，8，9，10和11）和碱溶时间（60，90，120，150和180 min）进行单因素试验，探究其对玉米胚芽蛋白提取率的影响。试验重复3次。
1.3.5 蛋白提取率的测定
采用凯氏定氮法（参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》）测定蛋白质含量，蛋白的提取率按式（1）计算。
蛋白提取率=（M1C1/M0C0）×100% （1）式中：M1为提取蛋白质的质量，g；C1为提取蛋白质的含量，%；M0为样品质量，g；C0为样品蛋白质含量，%。
1.3.6 响应面优化试验
根据对单因素试验的分析，选取料液比（A）、温度（B）、时间（C）为优化变量，响应面法优化提取工艺。保持碱提pH 9.5，以玉米胚芽蛋白提取率为指标，采用三因素三水平的Box-Behnken设计进行玉米胚芽蛋白提取试验。因素水平表见表1。
表1 响应面因素水平表
1.3.7 数据处理
所有试验均重复测定3次，结果取平均值。结果采用SPSS 19.0进行统计分析，显著性检验水平p=0.05；利用Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计，结果分析及预测。
2 结果与分析
2.1 玉米胚芽主要成分分析
玉米胚芽成分测定结果见表2。由表2可知：玉米胚芽中蛋白含量较高，可以作为试验原材料。
表2 玉米胚芽主要成分
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对蛋白提取率的影响
由图1可以看出，随着料液比的变化，蛋白提取率随之呈现先增加后下降的趋势。蛋白质的提取率在料液比1︰15（g/mL）时最高，当料液比继续增加后，蛋白提取率不断下降，此结果与任秀艳等[8]的研究结果相似。当料液比过低时，提取体系的过于浓稠，蛋白质无法充分溶出，随着提取的料液比的增大，脱脂粉在溶液中分散得越充分，越有利于反应的进行[9]。从生产成本以及提取效果上考虑，高料液比不适于蛋白的提取[10]。故选取提取料液比为1︰15（g/mL）。
图1 料液比对蛋白提取率的影响
2.2.2 时间对蛋白提取率的影响
由图2可以看出，随着提取时间的增加，蛋白的提取率呈现逐渐增大的趋势，但碱溶时间在150～180 min时，提取率增加趋势减缓。原因可能是随着时间的增加，玉米胚芽蛋白分子在碱溶液中的溶解度不断增加，最终达到一个平衡的状态，体系的蛋白组分不再溶出[11]。另外，提取时间过长会破坏蛋白质在溶液中的热稳定性，使蛋白发生结构以及颜色发生变化。综合考虑经济、效率等因素，选择150 min为最佳碱溶时间。
2.2.3 pH对蛋白提取率的影响
由图3可以看出，随着pH的升高，玉米胚芽蛋白的提取率显著提高。这是由于碱性环境使得蛋白质与水分子之间作用增大，蛋白质的溶解性随之提高。另外，玉米胚芽蛋白组成中碱溶蛋白高达79.9%，碱性条件有利于蛋白的提取[12]。但是，过强的碱性条件会使蛋白质分子的结构发生不可逆的变化，甚至转化成可能有毒的氨基酸，降低蛋白质的应用性[13]。综合考虑，选择pH 9.5较优。
图2 时间对蛋白提取率的影响
图3 pH对蛋白提取率的影响
2.2.4 温度对蛋白提取率的影响
由图4可知，随着温度的增加，蛋白提取率呈不断增加后下降的趋势。当温度达到55 ℃时，提取率达到最高，显著高于其他水平（p＜0.05）。原因可能是在40 ℃增加到55 ℃的过程中，温度不断升高，分子活动加剧，溶质的扩散能力加大，同时溶液的黏度降低，蛋白质的溶解度增加，从而提取率升高[14]。而温度达到60 ℃后，高温条件使得溶液中的淀粉分子发生糊化反应，黏度增大的糊状溶液导致提取的蛋白质难以继续溶解，所以蛋白质的提取率降低[15]。此外，温度过高促使结构发生变化，进而影响蛋白在食品中的功能性质。因此，选择较合适的碱提温度55 ℃。
2.3 响应面法优化试验及结果分析
2.3.1 回归模型分析
采用Box-Behnken的中心组合设计原理，以蛋白提取率为指标，利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析，试验组合与结果见表3，方差分析结果见表4。
图4 温度对蛋白提取率的影响
表3 试验组合及结果
表4 响应面方差分析
料液比（A）、温度（B）、时间（C）的二次多项回归方程为：Y=52.23+2.47A+3.25B+0.75C+0.51AB-1.1AC+0.035BC-2.82A2-5.46B2-3.21C2。
由表4可知，此回归模型是极显著的（p＜0.001）；同时该模型相关系数R2=0.995 3，校正系数R2Adj=0.989 3，说明模型置信度高，蛋白提取率与各因素间线性关系显著。因此，可通过回归方程确定玉米胚芽蛋白提取最优参数。模型中选取的关键因素均对蛋白提取率影响显著或极显著，A与C的交互影响表现为差异极显著，其余项差异均不显著。此外，通过F检验值可以得知各因素对试验结果的影响程度，F值越大，表明对试验结果的贡献率越大。因此，根据表3的F值得知，3个因素对蛋白提取率的影响程度依次为B＞A＞C，即温度＞料液比＞时间。
2.3.2 响应面分析
响应曲面的走向，可以反映出所选因素以及因素间的相互作用对玉米胚芽蛋白的提取率的影响。曲线的走势越明显陡峭，幅度越大，说明该因素对蛋白提取率的影响越大，反之，则影响越小。由图5可知，当温度（B）确定时，料液比（A）与时间（C）的交互作用对蛋白提取率的影响显著；料液比（A）与温度（B）的交互作用较为明显；温度（B）和时间（C）交互作用不显著，温度（B）和时间（C）的交互作用不显著，可能是该因素的主效应对试验结果的影响大于交互作用。结果表明，对玉米胚芽蛋白提取率影响最大的是温度，其次是料液比和时间，这与表4中回归分析结果是一致的。
图5 各因素交互作用响应面图
2.3.3 最佳工艺条件的确定及验证
通过Design-Expert 8.0.6软件对回归方程的分析计算，得到提取玉米胚芽蛋白的最佳条件：料液比1︰18（g/mL），温度53 ℃，碱提时间122 min。采用此最佳工艺进行实际操作，证明得到提取率为54.36%，与预测值53.25%接近，说明该回归模型适用于对试验结果的分析预测。
3 结论
此次试验探究了料液比、温度、碱溶时间、pH对玉米胚芽蛋白提取率的影响，并采用Design-Expert 8.0.6设计分析试验，得到最优蛋白提取工艺：料液比1︰18（g/mL）、温度53 ℃、pH 9.5、碱溶时间122 min。经实际操作，蛋白提取率为54.36%。此次试验为玉米胚芽蛋白的提取提供了借鉴，同时为玉米胚芽蛋白质资源的精深加工提供了理论基础和试验参考。
