内含子编码蛋白Mg2+结合位点功能分析及验证

崔古贞 陈相好 洪伟 张峥嵘 綦廷娜 陈峥宏

（1. 贵州医科大学基础医学院，贵阳 550025；2. 遵义医科大学第三附属医院（遵义市第一人民医院），遵义 563002；3. 贵州省普通高等学

校病原生物学特色重点实验室，贵阳 550025；4. 贵州省分子生物学重点实验室，贵阳 550004）

II型内含子（Group II intron）是一类反转录转座子（Retrotransposon），在细菌、古细菌以及真核生物叶绿体和线粒体基因组中广泛存在，尤其以细菌中最为普遍［1-4］。目前，通过现代基因组测序已鉴定了数千种细菌II型内含子，在鉴定的细菌II型内含子中，研究最为详细的主要包括两类，第一类是来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，Ll.LtrB）的嗜中温II型内含子［5-9］，另一类是来源于Thermosynechococcus elongatus及Geobacillus stearothermophilus的嗜高温II型内含子［2，10-12］。以此两类II型内含子为基础，利用其“归巢”机制，已开发出了高效基因打靶技术——Targetron技术（中温型）和Thermotargetron技术（高温型），并在多种微生物基因工程中获得广泛应用［13-19］。

II型内含子由内含子RNA和内含子编码蛋白（Intron encoded protein，IEP）两部分组成，其中内含子编码蛋白IEP具有DNA聚合酶、反转录酶、核酸内切酶等多种酶活性，在II型内含子“归巢”过程中发挥重要功能［20-21］。其“归巢”过程主要包括：首先，内含子RNA与内含子编码蛋白相互识别，组装为有活性的核糖核蛋白复合体（Ribonucleoprotein）。然后，内含子RNA通过碱基互补配对原则识别双链DNA靶位点。IEP蛋白在内含子RNA的辅助下，利用其自身的核酸内切酶活性反向剪切双链DNA，形成双链DNA缺口。然后，IEP蛋白的反转录酶活性，以切口处的3'-OH断端为引物，以内含子RNA为模板，反转录合成互补cDNA，再以新合成的cDNA为模板，通过DNA聚合酶活性合成双链DNA，最后通过DNA修复机制，实现内含子在靶位点的“归巢”［9，19，21］（图1）。

在整个内含子“归巢”过程中，高浓度Mg2+是保证其功能的重要条件，这也是II型内含子在真核生物细胞内效率极低的主要原因（真核生物细胞核内Mg2+浓度较低）［7-8，22-23］。IEP蛋白反转录酶活性在II型内含子的“归巢”过程中发挥重要功能，其Mg2+结合位点是影响其反转录功能的关键催化位点，如果能克服其依赖高浓度Mg2+的缺点，便有可能将II型内含子广泛应用于真核细胞的遗传改造。因此，为了研究Mg2+结合位点对II型内含子“归巢”效率的影响，本研究利用生物信息学手段筛选影响IEP与Mg2+结合的关键氨基酸催化位点，并利用基因工程手段对其进行定点突变，最后，构建突变型Targetron载体，在大肠杆菌中验证其功能，旨为深入研究II型内含子“归巢”机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、

图1 II型内含子“归巢”示意图

DNA Marker、DNA loading buffer购自北京全式金公司，DNA纯化及回收试剂盒、质粒提取试剂盒、快速定点突变试剂盒购自天根生化科技有限公司，蛋白胨、酵母膏、氯化钠，琼脂糖、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、氨苄青霉素购自北京索莱宝科技有限公司，限制性内切酶购自赛默飞公司，其他常用生化试剂均购自国药集团化学试剂公司。

1.1.2 仪器 WD-9413B成像仪、DYY-7C型电泳仪、Legend Micro 17R冷冻高速离心机、K960 PCR仪。

1.1.3 引物 本研究所用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.1.4 菌株及质粒 本研究所用菌株及质粒见表2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养 本研究所用的大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）均在37℃、LB液体或固体培养基中培养，氨苄青霉素使用浓度为100 μg/mL，蓝白斑筛选时加入X-gal（40 μg/mL）和IPTG（0.1 mmol/L）进行筛选。

表1 本研究用到的引物

表2 本研究用到的菌株及质粒

1.2.2 生物信息学分析 利用NCBI中的保守结构域数据库（Conserved Domain Databse，CDD），以来源于乳酸乳球菌Ll.LtrB的内含子编码蛋白序列为基础进行序列比对，分析保守的关键氨基酸位点，筛选与Mg2+结合的可能氨基酸残基。

1.2.3 定点突变 以IEP-F/IEP-R为引物扩增野生型IEP获得其DNA产物，并与pMD19T连接得到载体pMD19T-IEP，以载体pMD19T-IEP为模板，利用定点突变引物进行定点突变PCR，扩增体系为：模板pMD19T-IEP 1 μL，正向及反向突变引物均为2 μL，5×buffer 10 μL，DNA Polymerase 1.5 μL，加ddH2O至总体积为50 μL，PCR扩增条件为：95℃ 30 s，（95℃ 30 s，55℃ 20 s，72℃ 4 min）15个循环，72℃5 min。反应结束后加入1 μL的DpnI限制性内切酶，37℃条件下反应1 h去除模板质粒，随后转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR结合测序进行验证，最终获得含有IEP突变位点的载体pMD19T-M-IEP（图2）。

1.2.4 Targetron载体构建 利用NheI和BglII双酶切质粒pMD19T-M-IEP，与经同样酶切的载体pSY7-lacZ-635s、pSY7-lacZ-1063分别连接，连接体系为：载体1 μL，目的片段4.5 μL，T4 DNA ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 0.5 μL，加ddH2O至总体积10 μL，25℃反应1 h后转化感受态细胞E. coliDH5α，菌落PCR结合DNA测序验证突变型Targetron载体pSY7-M-lacZ-635s/1063a（图2）。下文所用到的突变型Targetron载 体pSY7-M3-lacZ-635s/1063a、pSY7-M4-lacZ-635s/1063a、pSY7-M5-lacZ-635s/1063a，其中M3表示IEP D308A单点突变，M4表示IEP D309A单点突变，M5表示IEP D308A/D309A双点突变。

1.2.5 打靶效率检测 将突变型Targetron载体pSY7-M-lacZ-635s/1063a与及野生型Targetron载体pSY7 -lacZ-635s/1063a分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，复苏后加入5 mL的LB液体培养基（含100 μg/mL 氨苄青霉素），37℃、180 r/min培养12 h。取50 μL过夜培养的菌液加入5 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min条件下培养1 h，随后加入IPTG使其终浓度为0.5 mmol/L，诱导45 min，以不同浓度的稀释度涂布LB固体培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L），37℃过夜培养，菌落PCR结合蓝白斑筛选计数计算其“归巢”效率（归巢效率=白斑/白斑+蓝斑×100%）。

1.2.6 菌落PCR验证 以lacZ基因打靶位点外侧引物进行菌落PCR验证，分别检测平板上的蓝色菌落及白色菌落，进一步验证IEP蛋白反转录结构域突变后对打靶效率的影响。

2 结果

2.1 IEP蛋白生物信息学分析

在NCBI数据库中，以乳酸乳球菌Ll.ltrB的IEP蛋白序列（HQ263410.1）为模板进行序列比对及分析，发现细菌II型内含子反转录酶具有极其保守的YADD序列（图3），结构预测表明其两个毗邻的天冬氨酸残基（DD）与Mg2+结合，可能是负责反转录功能的关键催化位点。因此，本研究选择这两个天冬氨酸残基为靶点，即D308和D309两个位点，构建突变型IEP蛋白突变体。

2.2 Mg2+结合位点突变对Ⅱ型内含子“归巢”效率的影响

图2 突变型IEP蛋白构建及打靶效率检测

图3 IEP蛋白生物信息学分析

为了验证D308A、D309A、D308A/D309A突变对II型内含子“归巢”效率的影响，将突变型IEP蛋白取代Targetron载体上的野生型IEP蛋白，构建Mg2+结合位点突变的Targetron载体，同时以野生型Targetron载体作为对照，分别转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导后涂布含有Xgal和IPTG的平板，过夜培养后通过菌落PCR（图4）及蓝白斑筛选（图5-A），分析IEP蛋白Mg2+结合位点突变对Ⅱ型内含子“归巢”效率的影响。研究结果表明，野生型Ⅱ型内含子在大肠杆菌中针对lacZ-635s位点的“归巢”效率为90.845%±6.792%，针对lacZ-1063a位点的“归巢”效率为92.582%±2.898%［24］；然而，将IEP蛋白反转录结构域Mg2+结合位点（D308A、D309A、D308A/D309A）突变后，平板均为蓝斑，菌落PCR验证其靶位点也没有任何内含子插入，其“归巢”效率均降低为0%（图4-5）。此结果表明，IEP蛋白反转录结构域Mg2+结合位点突变，失活了IEP蛋白的反转录功能，使Ⅱ型内含子不能以内含子RNA为模板合成cDNA而插入到DNA靶位点，即II型内含子完全失去其“归巢”功能。

3 讨论

细菌Ⅱ型内含子因其极高的“归巢”效率，目前已被设计为高效基因打靶工具，在革兰阴性细菌、阳性细菌中获得广泛应用。尽管在真核生物甚至人类细胞中也能够实现基因打靶功能［26-28］，但由于真核生物细胞核中Mg2+浓度较低，极大影响了其打靶效率，限制了其广泛应用。

内含子编码蛋白IEP在内含子“归巢 ”过程中发挥着重要的功能。IEP蛋白是由4个相对独立的结构域组成，包括：反转录结构域（RT）、成熟酶结构域（X）、DNA结构域（D）、核酸酶结构域（EN），此4个结构在功能上和空间上相对独立［1，8，29］。因此，突变其中一个结构域对其他结构域的影响相对较小。本研究通过突变RT结构域的Mg2+结合位点，获得了失活反转录功能的IEP蛋白，理论上对其他结构域的功能影响可能不大，这为深入研究II型内含子的功能提供了前提。

图4 突变型II型内含子功能验证

图5 蓝白斑筛选及“归巢”效率比较突变

此外，在以前工作中，我们已筛选到C164和Y208两个位点也是影响II型内含子“归巢”的核心催化位点，该位点突变后其“归巢”功能也完全丧失［24］，与本研究筛选的D308和D309位点具有相似的功能。然而，在IEP反转录过程中，C164和Y208两个位点分别与底物NTP和模板DNA结合，而D308和D309位点是与Mg2+结合，因此，D308和D309位点突变对其他结构域功能的影响可能比C164和Y208位点小。在后续研究中，我们以构建的Mg2+结合位点突变体为基础，发现该位点不但能失活II型内含子的“归巢”功能，而且还能在靶位点引入DNA损伤（数据尚未发表），表明D308和D309位点突变对II型内含子识别、切割DNA靶位点的影响较小，与C164和Y208位点突变相比，可能更有利用于II型内含子结构的稳定［29］。众所周知，靶向DNA损伤恰是基因编辑的前提［30］，预示本实验构建的突变型II型内含子可能具有基因编辑的潜能，因此，本实验构建的Mg2+结合位点突变体将为深入研究Ⅱ型内含子的功能及应用奠定良好的基础。

4 结论

本实验利用生物信息方法及定点突变技术，筛选并构建了IEP蛋白反转录结构域Mg2+结合位点突变体（D308A和D309A单点突变，D308A/D309A双点突变），并以大肠杆菌为基础，体内分析了IEP蛋白Mg2+结合位点突变对II型内含子“归巢”效率的影响，结果表明，Mg2+结合位点突变完全失活了II型内含子的“归巢”功能。