核糖体肽生物合成中的典型翻译后修饰研究

汪金秀 张琪 丁伟 陈拓

（1. 中国科学院西北生态环境资源研究院，兰州 730000；2. 复旦大学化学系，上海 200433；3. 中国科学院大学，北京 100049；4. 上海交通大学生命科学技术学院，上海 200030）

抗生素滥用导致细菌耐药性日趋严重，天然产物作为抗生素的主要来源，根据其生物合成途径的不同，可以分为聚酮、聚肽、萜类和生物碱等，其中聚肽类可分为非核糖体肽化合物（Non-Ribosomal Peptides，NRPs）和核糖体肽化合物（Ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides，RiPPs）两大类［1］，RiPPs 类天然产物因其化学结构和生物活性多样性在抗生素开发方面受到广泛的关注［2-3］。

RiPPs是以核糖体翻译合成的前体肽（Precursor peptide，一般由20-110氨基酸组成）为基础，经过一系列后修饰酶的化学修饰，最终生成的具有一定生物活性的多肽类天然产物。其生物合成逻辑具有共同的特征，即都来自于前体肽，前体肽由结构基因翻译出的N端前导肽（Leader peptide）和C端的核心肽（Core peptide，某些C端含有识别序列Recongnition sequence），具有潜在活性的核心肽被催化生成具有成熟活性的肽类天然产物，前导肽和识别序列最终被移除（图1）。核糖体肽复杂多样的翻译后修饰使其呈现出广泛的化学结构多样性多样性（图2）。

1 RiPPs分类及作用机制

细菌、真菌、植物及动物都可产生核糖体肽化合物［4］，其中，产生RiPPs最多的为细菌中的厚壁菌门［5］。目前，已知RiPPs有500余种，根据翻译后修饰特征及其形态特征，将其分为18类［6］（图3）。RiPPs不仅种类众多，生物活性更是多种多样。因发现较早，种类较多，羊毛硫肽是RiPPs中的“明星”家族，其代表分子Nisin长期用于食品保鲜剂［7］，但这些并不能掩盖其余RiPPs的光芒，如真菌来源的核糖体肽 Phomopsin A具有良好的抗肿瘤活性，Siamycin具有抗HIV活性［8］，Microcin具有抗革兰氏阴性菌活性［9］，Capistruin是RNA酶抑制剂［10］等。

图1 RiPPs类天然产物生物合成逻辑

图2 三种形态特征各异具有抗生素活性的核糖体肽类天然产物

图3 RiPPs种类

RiPPs类天然产物复杂多样的化学结构使其抗菌机制呈现多元化及多重化，现有研究表明RiPPs可以作用于细菌细胞壁、细胞膜、DNA、RNA或酶等［11］，如Salivaricin A2通过形成A环与细菌细胞 壁 的 脂 质II结 合［12］，Polytheonamides的β螺 旋二级结构及N-酰基辅助单元可以使细胞膜形成孔道［12-13］，Microcin J25是RNA聚合酶抑制剂等。有些RiPPs还具有多重抗菌机制［14］，既可抑制细菌细胞壁的形成，又可以使细胞膜穿孔，如Nisin［15］（图4）。

2 翻译后修饰

图4 Nisin作用机制及与lipid II作用图

复杂多样的翻译后修饰在RiPPs化学结构多样性和生物活性多样性中起着极其重要的作用［16］。这一重要过程的“主角”是前体肽（Precursor peptide）和修饰酶（Tailoring enzymes），前体肽由N端的前导肽（Leader peptide）和C端核心肽（core peptide）组成，核心肽被后修饰酶如脱水酶、氧化还原酶或环化酶等催化修饰，前导肽随后被一系列转运体、肽酶或两者的结合体移除，最终成为具有生物活性的成熟的核糖体肽类天然产物［16］（图5）。前导肽虽然最终被切掉了，但是在翻译后过程中，它是修饰酶、免疫以及输出过程必不可少的识别“卡片”。虽然生物合成酶识别前体肽的具体细节尚不清楚，但是研究表明大多数前导肽在溶液中或与生物合成蛋白结合时都倾向于形成α螺旋。前导肽和核心肽的长度在不同系统中差异很大，值得注意的是，其长度与成熟肽的长度并无相关性。前体肽通过翻译后修饰最终成为成熟的肽，修饰主要有脱水、环化和重排。此外，还可以形成二硫键和杂环，大环化和核苷酸化等［14］；根据修饰发生的位置，可以分为主链修饰和侧链修饰［17］。酶在各类翻译后修饰过程中具有举足轻重的作用［18］。

图5 RiPPs翻译后修饰过程［16］

2.1 侧链修饰

2.1.1 丝氨酸和苏氨酸脱水（Dehydratase） 丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）脱水是侧链常见修饰，含羟基的氨基酸Ser和Thr在脱水酶（Dehydratase）的作用下分别生成2，3-双脱氢丙氨酸（Dha）和（Z）-2，3-双脱氢丁氨酸（Dhb）［19］，丝氨酸和苏氨酸脱水形成的双键进而可以和分子内的巯基或胺基发生加成反应，生成醚或亚胺，这种分子内的亲电加成反应可以生成已知化学结构的RiPPs的中特征结构单元，如羊毛硫肽（Lanthionine），含氨基乙烯基半胱氨酸残基（AviCys）的多肽，含赖丙氨酸的多肽［20］（图6）。

图6 I型羊毛硫肽合成酶LanB催化丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）脱水［20］

2.1.2 半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸杂环化（Heterocyclization） 当来源于Cys，Ser或Thr的侧链硫醇或羟基亲核进攻相邻氨基酸的羰基碳时，分别形成噻唑啉，恶唑啉或甲基恶唑啉［21-22］，而α-β连接部分的进一步氧化，分别形成了噻唑环、噁唑环或甲基噁唑环（图7）。杂环化在RiPPs中具有重要作用，首先，杂环结构限制了肽骨架的构象，使多肽结构更稳定。其次，杂环作为非常通用的药效团，与含杂环的天然产物、蛋白质或核酸之间存在多种相互作用［23］。另外，噻唑常出现在许多铁载体中，这为某些含杂环的核糖体肽类物质充当金属螯合剂提供了可能性［23］。噁唑啉和噻唑啉氧化成噁唑环和噻唑环，这进一步限制了肽的构象，并能够显著影响生物活性。将噁唑啉/噻唑啉氧化成噁唑/噻唑可显著降低水解开环倾向［24］，这点是否具有生物相关性尚不清楚。最后，尽管Cys和Ser衍生的杂环是电子等排的，但已有论据证明噁唑啉/噁唑取代噻唑啉/噻唑之后会在极大程度上影响生物活性［25］。

图7 来源于半胱氨酸，丝氨酸和苏氨酸的杂环［22］

2.1.3 异戊二烯化（Prenylation） RiPPs中，在核心分子中加入异戊二烯衍生的亚基是极为普遍的。在初级代谢中，异戊二烯衍生对正常的细胞功能也至关重要，如蛋白的法尼基化和四异戊二烯化作用［26］。目前文献报道的异戊二烯化的RiPPs有2个家族，其一是从芽孢杆菌（Bacillus）分离的ComX信号肽家族。高度保守的Trp残基进行法尼基化（Farnesylated）或香叶基化（Geranylated），以生成异戊二烯化的肽。生物合成的异戊二烯化反应在异戊二烯基焦磷酸的1位C和Trp的3位C之间形成C-C键，同时在Trp的N原子和Trp的2位C之间形成新键，在Trp残基上形成第3个环［27］（图8）。其二是来自蓝细菌（Prochloronspp. cyanobacteria）的Cyanobactin peptides的修饰，有学者推测是通过由二甲基烯丙基焦磷酸化（DMAPP）得到，共价醚键由Ser/Thr羟基和DMAPP 3位C碳亲核反应形成［28］。来自蓝细菌的其他烯丙基化小肽在DMAPP的1位C或3位C处被修饰。通常，RiPPs的异戊烯化会增强其亲脂性［29］（图8）。

图8 Ser、Thr和Trp的烯丙基化后的结构［26］

2.1.4 SAM自由基修饰 在RiPPs中，自由基S-腺苷甲硫氨酸（RadicalS-adenosylmethionine，rSAM）蛋白质家族可以负责进行一些十分困难的生物学转化［30］。rSAM 中4Fe-4S簇通常与3个半胱氨酸残基连接，而这3个半胱氨酸残基通常是来源于易于识别的CxxxCxxC序列。Fe-S簇将电子转移到SAM上，对SAM的不稳定的S原子进行还原裂解，从而得到甲硫氨酸和5'-脱氧腺苷（5'-Ado）自由基（图9-A）［31］。该自由基被用于进行各种具有挑战性的合成反应，如Sactipeptide中 硫 醚 键 的 形 成（图9-B）［32-33］；随着家族成员的增多，rSAM蛋白的功能不断扩展，如那西肽（Nosiheptide）含有的吲哚酸衍生物就是由两种rSAM酶NosL和NosN催化的，NosL 负责L-色氨酸重排至3-甲基-2-吲哚酸（3-methyl-2-indolic acid，MIA）［34］（图9-C）。其中，NosL是rSAM家族中第一个可以同时使底物发生裂解和重排的酶。

此外，rSAM依赖的自由基酶催化多样性是RiPPs生物合成的一大研究方向和热点。

2.2 主链修饰

2.2.1 蛋白水解（Proteolysis） 前体肽的蛋白水解是RiPPs生物合成中的主要特征，除Pyrroloquinoline quinone（PQQ）和Cyanobactins在N端和C端都发生水解之外，蛋白水解一般发生在肽N端，蛋白水解后RiPPs才具有活性［35］（图2）。有些蛋白水解酶与ABC转运蛋白偶连在一起，即可以进行前体肽水解，同时也可以进行转运输出，如II型羊毛硫肽中LanT，Håvarstein等［36］认为这与前体肽序列中的双甘氨酸基序有关。每类RiPPs都有相同的前体肽保守序列作为前体肽水解酶的识别位点，I型羊毛硫肽前体肽保守序列位于位于-18和-15区，-1位的精氨酸和-4位的丙氨酸对于水解酶NisP的识别是必须的；II型羊毛硫肽和一些细菌素，识别位点为GG或GA［37］（图10）。因此，仅使用生物信息学方法就可以准确预测一些RiPPs最终产物的氨基酸组成。虽然前体肽最终被切除，但它在RiPPs的生物合成过程中具有重要意义，它不仅是修饰酶、免疫及输出过程必不可少的识别“卡片”，还能起到保护宿主的作用［38］。

图9 rSAM依赖的生物学转化

2.2.2 大环化（Macrocyclization） 真核生物中，RiPPs一般是N-C末端大环化，而在细菌RiPPs中，除了N-C大环化形成酰胺键之外，一些亲核侧链残基之间也可以形成酰胺键（图11），细菌来源的N-C端大环化的RiPPs在大小上差异较大，如Cyanobactins仅由6-12个氨基酸组成［39］，Uberolysin和Butyrivibriocin AR10等可以多达70个氨基酸，Subtilosin A有35个氨基酸，且除了N-C端的大环外，还含有硫醚键形成的小环［40］。RiPPs环化可以赋予化合物结构刚性以增加代谢稳定性，修饰N和C末端以限制外切蛋白酶降解的敏感性。有学者认为构象刚性可以让化合物更好的与目标靶点结合，另外环化特征也可以赋予化合物药理学特性［41］。

2.2.3 核苷酸化（Nucleotidylation） 核苷酸修饰在生物分子中十分常见，然而，在所有的细菌素中，仅Microcin C7（或被称为Microcin C51320）是被核苷酸化修饰过的［42］（图12）。这种修饰有趣之处在于通过形成氮磷磷酰胺键来实现核苷酸修饰。修饰后的Microcin C7是腺苷化的天冬氨酸Asp的结构类似物，而这个中间体可使得天冬酰胺-tRNA带上电荷。

图10 I型和II型羊毛硫肽和非羊毛硫肽细菌素的序列比对图［37］

图11 几种环化RiPPs［6］

图12 Microcin C7核苷酸化修饰［42］

2.2.4 形成内酯（Lactone formation） 细菌的RiPPs中，仅在革兰氏阳性细菌产生的Quorum sensing peptides中发现内酯，特别是产自葡萄球菌（Staphylococcus）的多种自诱导肽（Auto-inducing peptide，AIP）衍生物，这类自诱导肽衍生物含有5-9个氨基酸，结构中含有多个硫代内酯环［43］。一般是C末端的5个Cys残基上的巯基SH进攻末端羧基形成硫代内酯。而仅有两个特例，当5个Cys残基突变为Ser残基后，形成的是内酯而非硫代内酯。这种环状结构对于生物活性至关重要，某些细菌菌株会产生内酯酶，可以破坏Quorum sensing peptides［44］。

2.2.5 吡咯并喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）修饰 PQQ是细菌代谢中的氧化还原辅因子，具有独特的结构特征［45］。前体肽PqqA的长度为23-39个氨基酸，其具体长度取决于细菌种族。在前体肽PqqA中发现的是序列：Glu-Val-Thr-Leu-Tyr，与Cyanobactins一样，其C端和N端均会从前体肽中切除。在加工过程中，将Glu和Tyr连接在肽上，并切除所有其他氨基酸。在生物合成过程中形成1个C-C键和2个N-C键，通过几次氧化反应缩合生成PQQ杂环［46］（图13）。

图13 PQQ的形成过程［46］

正是这些种类繁多的后修饰反应，才造就了核糖体肽类抗生素的化学结构多样性和生物活性多样性。RiPPs生物合成酶的不断出现，极大拓展了我们对自然界有机反应及酶的进化适应性的认识。但是自然界还有大量RiPPs修饰酶未被表征，相应地，许多翻译后修饰的生物合成过程也依旧未揭开其神秘的面纱，这将是未来RiPPs研究的焦点和趋势所在。

3 基因挖掘与发现新的RiPPs

生物信息学的发展极大推动了RiPPs研究，利用编码前体肽或生物合成蛋白的基因之间的序列相似性，在DNA和蛋白序列数据的数量不断增加，以及有关RiPPs生物合成途径的不断更新的背景下通过生物信息技术与合成生物学相结合的方法，因此得以发现许多新的RiPPs［47-48］，RiPPs基因组挖掘策略如图14。目前，RiPPs基因组挖掘所用的工具通常有BLAST、BAGEL、antiSMASH、ClusterFinder和RiPP-PRISM等。Emmanuel开发的NeuRiPP系统利用深度神经网络（Deep neural network，DNN）模型可以在一定程度上预测新前体肽序列［49］，但是前体肽的识别仍然是一项需要继续完善的工作。有研究者分析了65 421个原核生物的基因组发现，编码RiPPs的原核生物多达20%，编码RiPPs基因组多达近2 000个［50］，而目前已知的RiPPs不过500余种，RiPPs具有极大的开发潜能。

通过比对各种数据库，一方面，可以根据前体肽（Precursor peptide）中保守的前导肽（Leader peptide）序列找到同一家族未被挖掘的RiPPs；另一方面，生物信息学揭示了许多生物合成途径可以利用同样的酶进行某一翻译后修饰过程，可以通过序列相似性网络图清楚了解目标酶所属的类群，从而更好更有目的性的去研究其结构和功能，如参与羊毛硫肽（Lanthepteptides）生物合成的Ser/Thr脱水酶也在硫肽和一些线性含唑肽（leucine aminopeptiolase，LAP）的生物合成途径中发挥作用［51-53］；而某些参与硫肽中噁唑和噻唑形成的酶也在LAP、肉毒杆菌素和蓝藻素的生物合成基因簇中发现；编码SAM自由基酶的基因也出现在硫肽和肉毒杆菌素（Bottromycins）的生物合成基因簇中［54-55］。由此可见，翻译后修饰酶基因的水平转移极大推动了化合物结构进化。基因组挖掘为发现更多的化学结构和生物活性新颖的RiPPs提供了加速器。

图14 RiPPs基因组挖掘策略流程图

4 总结与展望

来源于细菌、真菌、植物及动物的各类RiPPs，扩充了化合物的化学结构多样性和生物活性多样性。相较NRPs必须通过非核糖体肽合成酶功能改造才能获得化学结构新颖的类似物，RiPPs的优势在于可仅从基因水平上改变几个密码子来改变化合物的骨架结构，通过组合生物等改造手段获得多种具有生物活性的衍生物，其生物改造简单易行，这在新化合物合成和发现方面独具优势，尤其在细菌耐药性日益增强而新抗生素日渐式微的当下，RiPPs对于开发新药意义重大。RiPPs种类繁多的翻译后修饰过程研究不仅具有重要的理论价值，同时为代谢工程和合成生物学奠定了基础。

生物信息学的不断前进，势必会加速新RiPPs的挖掘，通过在各类数据库中比对保守的前导肽序列，找到同一家族未被挖掘的RiPPs，通过修饰酶序列相似性网络图清楚了解目标酶所属的类群，从而更有目的性的去研究其结构和功能，再结合合成生物学、分子生物学及生物化学等方法，完成从基因序列到活性化合物的研究过程，从而挖掘出更多结构和功能新颖的化合物。

此外，各类生物技术，如基因编辑技术、蛋白质工程和细胞工程等的不断进化和发展也是新RiPPs挖掘的加速器，相信随着这些技术的不断完善和进化，未来将有更多功能和结构新颖的RiPPs与我们见面。