高产阿魏酸酯酶菌株的筛选鉴定及其酶活测定条件优化

王祥锋 汪乔 袁慧君 王丽

（山东农业大学植物保护学院 山东省农业微生物重点实验室，泰安 271018）

阿 魏 酸 酯 酶（EC 3.1.1.73，Ferulic Esterase，FAE），属于羧酸酯水解酶亚类，该酶可以水解植物细胞壁中半纤维素之间、以及半纤维素与木质素之间由阿魏酸连接形成的酯键，提高木质纤维素降解效率的同时还释放出阿魏酸、p-香豆酸等抗氧化物质，FAE也具有参与合成酯类物质的能力［1］，在食品、造纸、饲料、医药、化妆品等行业具有很高的应用价值和广阔的市场前景［2-6］。

目前已报道的阿魏酸酯酶主要来源于微生物，其中研究最多的是黑曲霉Aspergillus niger，已经从中分离到多种阿魏酸酯酶，但酶活力普遍较低［7-9］。已报道的其他产阿魏酸酯酶的微生物菌株主要是从人和动物的肠道、反刍动物瘤胃中分离得到，大部分为厌氧微生物，分离培养较为困难，而且产生的酶活力较低，不能满足工业应用的要求［10-12］。鉴于阿魏酸酯酶具有的广泛用途，获得廉价和高活力的阿魏酸酯酶是推动其应用的前提，因此筛选容易培养且高产阿魏酸酯酶的菌株显得尤为重要。

大型真菌是菌物中能形成大型子实体的一类真菌，很多种类都具有较高的营养价值和药用价值，资源丰富、取材方便。大型真菌在生长过程中，能分泌一系列降解纤维素、半纤维素和木质素的酶，如漆酶、木素过氧化物酶、锰过氧化物酶、纤维素酶、木聚糖酶等［13-15］，由此可以推测，其中可能蕴藏着丰富的阿魏酸酯酶资源。基于此，本研究通过对实验室保藏的106株大型真菌菌株进行筛选并获得2个高产阿魏酸酯酶的菌株，进一步对其进行了分子生物学鉴定，并分别测定了2个菌株以米糠为培养基产阿魏酸酯酶的酶活曲线，优化了其粗酶液的酶活测定条件，为下一步阿魏酸酯酶的分离纯化和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 106株大型真菌菌株为山东农业大学菌物实训实践基地实验室保藏的菌株，其中包括采集于泰山周边的野生菌株和部分栽培食用菌菌株。

1.1.2 化学试剂 阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯购自Sigma公司。Taq DNA 聚合酶、dNTP等分子试剂购自北京全式金生物技术有限公司。其他常规试剂为国产分析纯。

1.1.3 培养基 PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，维生素B110 mg，琼脂19 g，水1 000 mL，pH自然。

初筛培养基：用分析天平称取酵母粉10 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.0 g，琼脂20 g，配制成1 L培养基，pH值自然；在高压灭菌锅中121℃灭菌20 min；冷却至60℃左右添加0.1%的阿魏酸乙酯（溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液，过滤除菌），摇至均匀的乳白色倒平板［16］。

固体发酵培养基：麦麸或米糠10 g，加入无机盐溶液（g/L，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g）13 mL，搅拌均匀后于121℃下灭菌30 min，冷却至室温。

1.2 方法

1.2.1 平板法初筛 将106株大型真菌的菌株进行活化，之后用0.5 cm直径的打孔器打孔，接种到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的初筛培养基平板上，25℃恒温培养3 d，观察是否出现透明水解圈，并测定透明圈直径，重复3次。若菌株可以产生阿魏酸酯酶，则会分解培养基中的底物阿魏酸乙酯而形成透明圈，透明圈的直径大小反应阿魏酸酯酶的活性高低，根据透明圈大小初步筛选出阿魏酸酯酶活力高的菌株。

1.2.2 固体发酵培养复筛 将初筛得到的16个菌株，在PDA平板上活化后用直径1 cm的打孔器打孔，分别接种3块圆饼到装有无菌固体麦麸和米糠培养基的三角瓶中，25℃恒温培养6 d。每个处理3个重复。培养结束后向每个三角瓶中加入50 mL磷酸缓冲液，搅拌均匀后置于40℃恒温水浴锅内，浸提25 min；过滤收集浸提液后于4℃、10 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液，用于酶活的测定。

1.2.3 阿魏酸酯酶酶活的测定 取10 μL粗酶液加入到400 μL阿魏酸甲酯溶液（50 μmol/L，pH 5.0）中，混合均匀，置于40℃水浴锅中反应30 min，反应完成后在分光光度下测定340 nm处的吸光度［17］，对照组在测定前加入10 μL酶液，其余条件相同。该方法测定原理为阿魏酸甲酯在340 nm下具有最大光吸收，阿魏酸酯酶可以降解阿魏酸甲酯中的酯键使吸光度下降，通过测定340 nm下的吸光度差值（ΔA340）来计算不同样品的相对酶活。

1.2.4 菌株的ITS分子鉴定 将经过初筛和复筛后获得的两株高产阿魏酸酯酶的菌株在PDA平板中培养，收集菌丝体，采用液氮研磨法提取基因组DNA，采用ITS通用引物，ITS1：5'-T C C G T A G G T G A A C C T G C G G-3'，I T S 4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃ 5 min；95℃ 0.5 min，58℃ 0.5 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。将PCR产物送华大基因科技有限公司纯化后测序。

1.2.5 序列同源性分析及系统发育树的构建 使用Blast功能将测得的ITS序列在GenBank中进行同源性比对，下载同源性高的序列并使用Mega 5.2 软件进行系统发育树的构建。

1.2.6 发酵米糠产阿魏酸酯酶的酶活曲线测定 将筛选获得的两株高产阿魏酸酯酶的大型真菌菌株接种到PDA平板上培养，菌丝长满后用直径1 cm的打孔器打孔，分别接种3块圆饼状菌块到灭菌的米糠培养基中。25℃培养，每隔1 d取样进行酶活测定，共培养14 d。

1.2.7 粗酶液酶活测定条件优化 采用单因素法，分别考察反应体系中温度、酶液添加量和反应时间等对两个菌株粗酶液阿魏酸酯酶酶活测定的影响。

分别收集两个菌株粗酶液活性最高的发酵液，以20 μL粗酶液、400 μL阿魏酸甲酯溶液、40℃和30 min反应时间作为基础反应条件。单一改变基础反应条件中的变量，分别测定粗酶液添加量为10、20、30、40、50 μL时，反应时间为10、15、20、25、30、35、40 min时，反应温度为20、30、40、50、60℃时，两个菌株粗酶液中阿魏酸酯酶的活性。以每个因素中酶活力最高者为100%，其他各梯度下与该酶活的比值为该单因素下的相对酶活。计算确定两个菌株粗酶液阿魏酸酯酶活性的最佳测定条件。

2 结果

2.1 产阿魏酸酯酶大型真菌菌株的初筛

将106个大型真菌菌株通过透明圈法进行产阿魏酸酯酶的初筛，发现92个菌株都可以产生透明圈，其中有16株菌株产生的透明圈直径较大（≥3 cm），结果如图1所示。从图中可以看出，菌株M产生的透明圈最大，C、D、E、F、N和P等6个菌株产生的透明圈大小相近。通过透明圈大小反应了各个菌株产阿魏酸酯酶的活性高低。

2.2 高产阿魏酸酯酶大型真菌菌株的复筛

将初筛获得的16株高产阿魏酸酯酶的菌株分别接种到麦麸培养基和米糠培养基中进行固体发酵复筛，测定各菌株的阿魏酸酯酶活性，其结果见图2、3。由图中可以看出，不同菌株在两种培养基上表现出不同的产酶情况，A、C、D、F、H、I、K、M、N、O等10个菌株在麦麸和米糠培养基中都能产生较高活力的阿魏酸酯酶；而菌株L只在麦麸上可以产生高活力阿魏酸酯酶；菌株J只在米糠上可以产生高活力阿魏酸酯酶；菌株B、E、G、P在两种培养基上产酶活性都比较低。最后选择在两种培养基上活性都较高且长势较快的菌株D和M进行分子鉴定。

图1 16株菌株的透明圈直径大小

图2 发酵麦麸培养基中16个菌株的阿魏酸酯酶活性

2.3 菌株分子鉴定

对菌株D和M分别进行ITS序列的扩增并进行电泳检测。PCR产物扩增条带单一，经测序，菌株D和M的ITS序列长度分别为630 bp和662 bp，使用Blast功能将测得的ITS序列在GenBank中进行同源性比对，并与其他同源性高的菌株进行系统发育树的构建，结果如图4所示。结果显示菌株D与一色齿毛菌Cerrena unicolor的相似性最高，达99%；菌株M与血红密孔菌Pycnoporus sanguineus的相似性最高，达99%。结合子实体形态（图5），最终鉴定菌株D为一色齿毛菌，菌株M为血红密孔菌。

2.4 两个菌株发酵米糠产阿魏酸酯酶的酶活曲线

图3 发酵米糠培养基中16个菌株的阿魏酸酯酶活性

分别对两个菌株固体发酵米糠产阿魏酸酯酶情况进行了测定，酶活力随发酵时间变化曲线见图6，由图中可以看出，菌株D从第2天开始产酶，第4天达到产酶高峰，随着培养时间增加，酶活力开始缓慢下降；菌株M从第4天开始产酶，第6天酶活最高，之后随着培养时间增加，酶活力开始下降。发酵14 d，两个菌株粗酶液中依然具有较高的阿魏酸酯酶活性。

2.5 粗酶液阿魏酸酯酶酶活测定条件优化

图4 菌株D、M的ITS序列系统发育树分析

图5 两个菌株的野外子实体图片

分别收集两种菌发酵米糠产酶活性最高的粗酶液（一色齿毛菌发酵4 d，血红密孔菌发酵6 d）进行阿魏酸酯酶活性测定条件的优化，主要包括最佳粗酶液添加量、最适反应温度、最佳反应时间等指标，具体结果如下所述。

2.5.1 粗酶液酶活的最适反应温度测定 分别在20-60℃测定两个菌株粗酶液中阿魏酸酯酶的活性，结果见图7。由图中可以得出，一色齿毛菌的阿魏酸酯酶最适反应温度为40℃，在30℃和50℃分别保留73%和94%的活性；血红密孔菌的阿魏酸酯酶最适反应温度为50℃，随着温度升高，活性迅速下降，60℃时仅剩余40%的活性。

图6 两个菌株的酶活力随发酵时间变化曲线

图7 两个菌株粗酶液中酶活最适反应温度测定

2.5.2 粗酶液酶活的最佳反应时间测定 分别测定了反应时间为10、15、20、25、30、35、40 min时，两个菌株粗酶液中阿魏酸酯酶的活性，结果见图8。由图中可以看出，随着反应时间的延长，两个菌株粗酶液中的酶活性逐步增加，当反应时间达到35 min时，酶活性达到最大。之后随着时间增加，酶活性开始下降。

2.5.3 粗酶液添加量对酶活力的影响 分别测定了不同粗酶液添加量（10、20、30、40、50 μL）对酶活测定结果的影响，结果见图9。由图中可以看出，两个菌株的酶活力变化趋势相似，当粗酶液添加量较低时，随着粗酶液的增加，酶活力也增加，当粗酶液添加量为20 μL时两个菌株的酶活力最高，并趋于稳定，当添加量大于30 μL时酶活力开始下降。

3 讨论

图8 两个菌株粗酶液中酶活最佳反应时间测定

图9 粗酶液添加量对酶活力的影响

阿魏酸酯酶可以降解由阿魏酸形成的酯键，因此通常采用是否可以降解阿魏酸乙酯产生透明圈来进行酶活初筛［16，18-19］。本研究通过平板透明圈法初筛得出86.8%的供试大型真菌菌株都具有降解阿魏酸乙酯的能力，根据透明圈大小进一步筛选出16个降解活性高的菌株，由此反映出大型真菌中阿魏酸酯酶的普遍性。这与Haase-Aschoff等［20］在担子菌中的检测结果一致，他们以阿魏酸甲酯、肉桂酸甲酯和3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯3种阿魏酸酯衍生物为底物检测了41株担子菌发酵产阿魏酸酯酶的情况发现，61%的菌株对至少一种阿魏酸酯衍生物表现出降解活性。

阿魏酸酯酶是诱导酶，而且有多种不同类型，只有当培养基中含有阿魏酰酯键类结构时才会被诱导产生。研究发现，不同真菌的阿魏酸酯酶诱导培养基是不同的，而且同一菌株经不同培养基诱导可以产生不同类型的阿魏酸酯酶［5，21］。麦麸、米糠等谷物的壳中含有大量的阿魏酰酯键结构，可作为阿魏酸酯酶的诱导底物［22］。本实验中，在对初筛获得的16株高效降解阿魏酸乙酯的菌株进行固体发酵麦麸和米糠产阿魏酸酯酶复筛时也发现，这些菌株在3种底物上表现出了不同的产酶活性，推测原因为有些菌株在不同的诱导培养基上分泌了不同类型的阿魏酸酯酶，具体验证还需要首先获得各菌株在不同底物上分泌的阿魏酸酯酶的基因序列。

对筛选到的在阿魏酸乙酯、麦麸和米糠等3种培养基上都可以产生高活力阿魏酸酯酶的2个菌株进行分子鉴定，并结合野外子实体形态得出，2个菌株分别为一色齿毛菌Cerrena unicolor和血红密孔菌Pycnoporus sanguineus，目前还未有关于这两种大型真菌中阿魏酸酯酶的报道。这两种菌在自然界中分布广泛且生长迅速，推测这与其生长过程中分泌的丰富木质纤维素降解酶是密切相关的［23-24］。

阿魏酸酯酶是木聚糖支链降解酶，经该酶降解后才进一步暴露出木聚糖和纤维素主链，因此在木质纤维素的降解中发挥“先锋军”作用，通常在发酵早期就开始分泌［4-5，25］。本实验中，2个菌株发酵米糠时均是在发酵前期就可以产生阿魏酸酯酶，且分别在第4天和第6天达到高峰，发酵14 d时依然保持较高活性，反映出阿魏酸酯酶在米糠降解中发挥关键的作用。分别选取2个菌株发酵米糠产酶活性最高的粗酶液对阿魏酸酯酶活性测定条件进行了优化，在粗酶液添加量的优化实验中发现，两个菌株的酶活趋势相似：当粗酶液添加量较低时，随着粗酶液的添加，酶活性先增加后趋于稳定，但当粗酶液高于一定值时，酶活性开始下降，推测粗酶液中含有其他影响酶活测定的成分，当增加到一定量时会对酶活测定结果产生影响，所以在酶活测定中应严格控制酶液的添加量。以上实验为后续开展该酶的分离纯化和进一步的应用提供了理论依据。

阿魏酸酯酶在木质纤维素高效降解和阿魏酸的生物法生产中发挥重要作用［5，26］，本研究发现该酶在大型真菌中普遍存在，而且筛选到2株高产阿魏酸酯酶的菌株，这不仅丰富了大型真菌中的阿魏酸酯酶资源，而且还为揭示大型真菌对木质纤维素的高效降解机制提供了一定的思路。

4 结论

本研究从106个大型真菌菌株中筛选获得2个高产阿魏酸酯酶的菌株，经分子鉴定分别为一色齿毛菌和血红密孔菌。两个菌株发酵麦麸和米糠都可以产生较高活力的阿魏酸酯酶，2个菌株发酵米糠时分别在第4天和第6天达到高峰，分别收集活性最高的粗酶液进行阿魏酸酯酶的酶活条件测定，结果表明：一色齿毛菌在40℃、反应时间为25 min、添加400 μL阿魏酸甲酯溶液和30 μL粗酶液条件下降解效率最高；血红密孔菌在30℃、反应时间为35 min、添加400 μL阿魏酸甲酯溶液和20 μL粗酶液条件下降解效率最高。