HPLC 法同时测定退赤胶囊中8 种成分

朱应成 余 静 刘亮镜 徐 斌

（芜湖市中医医院制剂中心， 安徽 芜湖241000）

退赤胶囊具有清热、明目、退翳之功效，临床上主要用于治疗目赤肿痛、畏光、流泪之结膜炎、角膜炎、角膜云翳等外障眼疾［1］，为本课题组联合芜湖市中医医院眼科专家根据多年临床经验总结创制而成，是由金银花、菊花、连翘、黄芩、桔梗、木贼、密蒙花、谷精草、蒺藜、车前子、甘草11 味药材经现代制药技术加工而成的纯中药制剂（皖药制字Z20050017）。方中君药金银花、菊花及臣药连翘均具有清热解毒、疏散风热的功效，主治风热上攻之目赤肿痛［2⁃3］；臣药黄芩含有黄芩苷，具有抗菌、抗病毒的药理作用［4⁃5］。

退赤胶囊组方药味较多，化学成分较复杂，但该制剂现行质量标准仅对连翘酯苷A 进行定量分析，无法全面反映其内在质量，难以实现有效监控。因此，本实验采用HPLC 法同时测定退赤胶囊中绿原酸［6⁃8］、咖啡酸［6⁃7］、阿魏酸［8］、芦丁［6⁃8］、连翘酯苷A［9］、连翘苷［9］、黄芩苷［4］、甘草苷［10］的含有量，以期保障该制剂质量的均一性和临床疗效的稳定性。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（PDA）（美国Waters 公司）；XP⁃205型电子分析天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；KQ⁃500B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

退赤胶囊（自 制，批 号 181101、181102、181103、181104、181201、181202）。绿原酸（批号110753⁃201314，纯度96.6%）、咖啡酸（批号110885⁃200102，纯度100%，置于五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h 后使用）、阿魏酸（批号110773⁃201313，纯度99.6%，置于五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h 后使用）、甘草苷（批号111610⁃201106，纯 度 93.7%）、芦 丁（批 号100080⁃201409，纯度91.9%）、连翘酯苷A（批号111810⁃201707，纯 度97.2%）、黄芩苷（批 号110715⁃201318，纯 度93.3%）、连翘苷（批 号110821⁃201112，纯度96.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB⁃C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（含0.1%磷酸）（A）⁃水（含0.1%磷酸）（B），梯度洗脱（0～22 min，9%A；22～23 min，9%～14%A；23～55 min，14%A；55～85 min，14%～28%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温20 ℃；检测波长277 nm（甘草苷、黄芩苷、连翘苷）、330 nm（绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、连翘酯苷A）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取咖啡酸、甘草苷、绿原酸、连翘酯苷A、阿魏酸、芦丁、黄芩苷、连翘苷对照品适量，甲醇稀释，摇匀，滤过，即得（各成分质量浓度分别为7.71、18.45、31.03、17.19、5.50、8.18、93.94、9.38 μg／mL），在4 ℃下避光保存。

2.2.2 供试品溶液 取胶囊内容物适量，取约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得，在4 ℃下避光保存。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例，制备缺菊花、金银花、甘 草、连翘、黄芩的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 系统适应性考察与专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰峰形良好，阴性无干扰。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、3、5、10、15、20 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得各成分峰面积RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取同一批胶囊（批号181101）2 g，共6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分含有量RSD 均小于2.0%，表明该方法重复性好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含有量已知的胶囊（批号181101）内容物约1 g，共6 份，精密称定，置于50 mL 锥形瓶中，加入对照品溶液适量，再精密加入50 mL 70%甲醇，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、甘草苷、芦丁、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷平均加 样回收 率（RSD）分别为 101.8%（0.7%）、102.6%（1.8%）、103.9%（1.5%）、96.9%（2.2%）、101.8%（0.9%）、99.9%（2.4%）、101.3%（2.5%）、102.8%（2.2%）。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.9 样品含有量测定 取6 批胶囊，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（μg／g）Tab.2 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 讨论

3.1 检测波长筛选 本实验采用PDA 检测器，在210～400 nm 波长处进行扫描，发现甘草苷、黄芩苷、连翘苷在277 nm 处有较强吸收，而绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、连翘酯苷A 在330 nm 处有较强吸收。因此，确定检测波长为277、330 nm。

3.2 流动相筛选 本实验考察了乙腈⁃磷酸［11］、甲醇⁃磷酸［12⁃13］、甲醇⁃冰醋酸［14］、甲醇⁃甲酸［9］等流动相，发现以乙腈⁃水（含0.1% 磷酸）洗脱时各成分均实现良好分离，与相邻峰无干扰。另外，在乙腈中加入0.1%磷酸后各成分色谱峰峰形更对称，系统稳定性更好，可应用于分析时间较长的多成分含有量测定［15］。

3.3 供试品溶液制备方法筛选 本实验比较了不同提取溶剂（70% 甲醇、90% 甲醇）、提取方法（超声、加热回流）、提取时间（30 min、1 h）的效果，发现2 种提取方法下各成分含有量相差不大，从操作简便的角度考虑，选择超声提取；70%甲醇提取时，各成分提取率最高；2 种超声时间对提取影响不大。最终确定，供试品溶液制备方法为70%甲醇超声提取30 min。

4 结论

本实验采用HPLC 法同时测定退赤胶囊中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、甘草苷、芦丁、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷的含有量，该方法简便可靠，重复性好，可用于该制剂质量控制。