金母颗粒提取工艺的优化

李晓霞 王志萍 ∗ 蒋雅娴苏佳昇刘 笑王孝勋冯 桥

（1.广西中医药大学， 广西 南宁530001； 2.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室， 广西 南宁530001； 3.广西国际壮医医院， 广西 南宁530001）

金母方是课题组前期优化壮药经验方——妇雅净方而成，由金刚刺、火炭母、白背叶根等9 味特色壮药材组成，具有清火毒、除湿毒、灭虫毒、通龙路和水路等功效，临床上主要用于治疗阴道炎、慢性宫颈炎、子宫内膜炎、附件炎。方中火炭母、虎杖、黄柏所含有效成分大多为醇溶性物质［1］，对盆腔炎性疾病后遗症的疗效显著，而且毒性较小，工艺简便，质量可控［2⁃4］。该方原剂 型为汤剂，现拟将其改为颗粒剂，选用何种溶剂及工艺进行提取是决定该制剂临床疗效的关键。

目前，优化中药复方提取工艺已成为研究热点，有学者以成分含有量或结合干浸膏提取率为评价指标，正交实验、星点设计或结合人工神经网络优化提取工艺［5⁃7］；还有学者先以正交试验优化提取工艺，再通过药效学实验对其进行验证［8］。本实验选择抗炎、抑菌活性作为主要考核指标，并结合星点设计⁃效应面法来优化壮药金母颗粒提取工艺。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；SQP 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；LDZX⁃75KBS 型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DFY⁃1000型摇摆式高速万能打粉机（上海精胜科学仪器有限公司）；HWS⁃26 型电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；LPH⁃250⁃A 型生化培养箱（广东泰宏君科学仪器股份有限公司）；DHG⁃9140A型电热鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；98⁃1⁃B 型电子调温电热套。

1.2 试剂与药物 金刚刺（批号Y18080604）、火炭母（批号17070202）、土茯苓（18031901）、白背叶根（批 号 Y18101502 ）、虎 杖（批 号18051501）、犁头草（批号Y18080604）等药材均购自广西宝正药业有限公司，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为正品，符合2015 年版《中国药典》 一部或《广西壮药质量标准》 各药材项下要求。地塞米松（批号171702，广东南国药业有限公司）；营养琼脂（批号1080331）、水解酪蛋白胨（MH）肉汤（批号1069061）（广东环凯微生物科技有限公司）；红四氮唑［批号I18007011，阿拉丁试剂（上海）有限公司］。虎杖苷（111575⁃01603，纯度87.3%）、落新妇苷（111798⁃01504，纯度93.9%）对照品（中国食品药品检定研究院）。乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 动物 SPF 级雌性昆明种小鼠32 只，体质量（20±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2016⁃0002。

1.4 细菌 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，均由广西中医药大学微生物与免疫实验中心提供。

2 方法与结果

2.1 虎杖苷、落新妇苷含有量测定

2.1.1 色谱条件 Inertsil ODS⁃3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃水（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长291 nm；进样量10 μL。理论塔板数以虎杖苷计，不低于3 000；以落新妇苷计，不低于5 000。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取虎杖苷、落新妇苷对照品适量，稀乙醇制成每1 mL 分别含两者32 μg、0.5 mg 的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 将金母颗粒提取液定容至2 000 mL量瓶中，混匀后精密量取5 mL，4 000 r／min离心10 min，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.4 阴性样品溶液制备 按处方工艺取缺虎杖、缺金刚刺、缺土茯苓的阴性样品适量，加10 倍量60%乙醇提取2 次，每次1 h，300 目滤布过滤，浓缩后60%乙醇定容于2 000 mL 量瓶中，精密量取5 mL，4 000 r／min 离心10 min，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.5 线性范围考察 取对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为虎杖苷Y＝8×106X＋8 163.1（R2＝0.999 9）、落新妇苷Y＝2×106X＋72 995（R2＝0.999 2），分别在0.010 9～0.314 3、0.117 6～3.380 4 μg 范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得虎杖苷、落新妇苷峰面积RSD 分别为2.88%、1.50%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取药材6 份，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得虎杖苷、落新妇苷峰面积RSD 分别为0.99%、1.47%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，于2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得虎杖苷、落新妇苷峰面积RSD分别为2.19%、2.96%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率试验 精密量取虎杖苷、落新妇苷含有量已知的供试品溶液9 份，精密加入对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得虎杖苷、落新妇苷平均加样回收率分别为99.46%、100.84%，RSD 均小于5%。

2.2 提取溶剂种类筛选

2.2.1 提取物制备 按处方比例称取药材共109 g，平行2 份，加入10 倍量水、60%乙醇加热回流提取2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，精密量取2 mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算虎杖苷、落新妇苷含有量。将提取液浓缩至近干，取浸膏适量，灭菌纯水制成1 000 mg 生药／mL药液，依次稀释至500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 mg 生药／mL，供体外抑菌实验用；另取浸膏适量，纯水制成708.5 mg 饮片／mL 药液，供棉球致小鼠肉芽肿实验用。

2.2.2 棉球致小鼠肉芽肿实验 参考文献［9］报道。32 只小鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.04 mL／10 g）麻醉后，将已高压灭菌的5 mg 棉球植于腋下。24 h 后，将小鼠随机分为模型组、阳性组（地塞米松）、金母颗粒水提物组、金母颗粒醇提物组，每组8 只，均以0.2 mL／10 g 剂量灌胃给予相应药物（模型组给予等量蒸馏水），连续7 d，于第8 天处死小鼠，打开原切口，将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，置于60 ℃烘箱中干燥12 h，精密称定质量，将其减去原棉球质量，即为肉芽肿质量，再计算其抑制率，结果见表2。由此可知，与模型组比较，金母颗粒水提物组、金母颗粒醇提物组肉芽肿质量降低（P＜0.01），以后者更明显（P＜0.01）。

表2 金母颗粒对肉芽肿质量、抑制率的影响（，n＝8）Tab.2 Effects of Jinmu Granules on the weight and inhib⁃itory rate of granuloma（， n＝8）

表2 金母颗粒对肉芽肿质量、抑制率的影响（，n＝8）Tab.2 Effects of Jinmu Granules on the weight and inhib⁃itory rate of granuloma（， n＝8）

注：与模型组比较，∗∗P ＜0.01；与金母颗粒水提物组比较，＃＃P＜0.01。

2.2.3 体外抑菌实验 参考文献［9］报道。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液在4 000 r／min下离心15 min，弃去溶液，沉淀加生理盐水制成菌液浓度1×108CFU／mL 的混悬液。在96 孔板最外围的一圈中加入200 μL 水，往B2～B11、C2～C11、D2～D11、F2～F11、G2～G11 孔里加入“2.2.1” 项下药液、混悬液各100 μL，往E2～E4、E5～E7 孔里加入混悬液各200 μL，缓慢摇匀后置于生化培养箱中，在37 ℃下培养24 h。配制1%红四氮唑溶液（现用现配），过0.22 μm 微孔滤膜，各取5 μL 加到每孔中，摇匀，置于37 ℃生化培养箱中培养4 h，观察各孔显色情况，未显现粉红色的最低浓度即为最小抑菌浓度（MIC）。结果，金母颗粒水提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC 均为62.50 mg／mL，而醇提 物对两者的 MIC 均 为31.25 mg／mL，即其抑菌活性更强，与 “2.2.2”项下结果一致。

2.2.4 虎杖苷、落新妇苷含有量测定 取“2.2.1”项下水提液、醇提液各2 mL，过0.22 μm微孔滤膜，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算虎杖苷、落新妇苷含有量。结果，金母颗粒水提物中两者分别为0.277 5、1.685 0 mg／g，而醇提物中分别为1.144 5、5.551 2 mg／g，即在后 者中更 高，与“2.2.2” 和“2.2.3” 项下结果一致。

2.3 乙醇体积分数筛选 按处方比例称取药材共109 g，平行5 份，分别加入10 倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加热回流提取2 次，每次1 h，300 目滤布过滤，合并滤液，真空浓缩回收溶剂至无醇味，转移到蒸发皿中，水浴至近干，提取液用灭菌纯水制成1 000 mg 生药／mL 药液，依次稀释至500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 mg 生药／mL，按“2.2.3” 项下方法进行实验，结果见表3。由此可知，乙醇体积分数在50%～90%范围内均能不同程度地抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌增殖，以60%时最强。

表3 乙醇体积分数对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌MIC 的影响（mg／mL）Tab.3 Effects of ethanol concentration on the MICs of Staphylococcus aureus and Escherichia coli（mg／mL）

2.4 星点设计⁃效应面法 对金母颗粒有效成分进行分析后，将虎杖苷、落新妇苷含有量权重系数均设定为0.4；干膏率为次要指标，故将其权重系数设定为0.2，采用Hassan 法对各指标进行数学转换后计算“归一值”（d），公式为di＝（Yi-Ymin）／（Ymax-Ymin），其中Ymax为指标最大值，Ymin为指标最小值，Yi为指标i测定值，i为指标数，再将其进一步转换为总评“归一值”（OD），公式为OD＝，其中d1为虎杖苷含有量 “归一值”，d2为落新妇苷含有量“归一值”，d3为干膏率“归一值”。

选择乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、乙醇用量（C）作为影响因素（提取次数为非连续变量，无法进行回归处理，故按前期单因素试验结果将其固定为2 次），落新妇苷、虎杖苷含有量及干膏率作为评价指标，设计3 因素5 水平试验。因素水平见表4。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

按处方比例称取药材共109 g，按表4 参数加热回流提取2 次，300 目纱网过滤，收集滤液，测定提取液中虎杖苷、落新妇苷含有量及干膏率，计算OD值（Y），结果见表5。

对表5 数据分别进行多元线性回归、二项式拟合，方程Y＝-0.860 66＋0.013 828A＋0.003 249B＋0.055 85C（R2＝0.384 0，P＝0.046 5）、Y＝-4.150 96 ＋0.092 55A＋0.044 78B＋0.138 1C-0.000 234 3AB-0.009 839AC＋0.000 055 62BC＋0.000 302 1A2-0.000 337 5B2＋0.020 36C2（R2＝0.701 7，P＝0.075 3），可知二项式方程R2明显高于多元线性回归方程，故本实验选择其优化提取工艺。方差分析见表6，可知各因素影响程度依次为A＞C＞B，其中A有显著影响（P＜0.05）。响应面分析见图1。

表5 试验设计与结果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

图1 各因素响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors

由此确定，最优提取工艺为加热回流提取2 次，第1 次加10 倍量60%乙醇，第2 次加8 倍量60%乙醇，每次45 min。再按照上述优化工艺进行3 批验证试验，测得OD值分别为0.764 1、0.780 3、0.763 0，平均0.769 1，RSD 为1.26%，表明工艺稳定可行，重复性良好。

3 讨论

壮药金母方原剂型为汤剂，但因其服用、保存不便，故将其制成颗粒剂。该方主要用于治疗慢性盆腔炎，其病因为前期细菌感染、反复发作而形成炎症［10］，方中主药金刚刺、土茯苓主要成分为落新妇苷，虎杖主要成分为虎杖苷，两者均具有抗炎抑菌的作用，可反映全方有效性［11⁃15］，故本实验以抗炎、抑菌活性为主要考核指标来筛选提取溶剂。在工业生产过程中，乙醇体积分数会对安全性、生产成本产生影响，故本实验又通过操作简便的体外抑菌实验来筛选其体积分数。

中药复方制剂临床疗效是方中各药材发挥协同作用的结果，故方中单一成分不能全面反映其整体性和有效性。目前，常选择有效成分含有量、干膏得率的加权综合评分作为评价指标［16⁃18］，故本实验采用虎杖苷、落新妇苷含有量及干膏率来综合评价金母颗粒提取工艺的优化效果。

另外，以抗炎、抑菌活性为主要考核指标时，金母颗粒最优提取溶剂为60%乙醇；以虎杖苷、落新妇苷含有量为主要考核指标时，乙醇最优体积分数为70%，两者不一致。最终确定，以抗炎、抑菌活性为主，从而突出基于该方药效的核心地位。