一测多评法同时测定克感额日敦片中9 种成分

季正栋 苏 丹 唐丽丹 房燕冬

（1.南京医科大学附属常州市第二人民医院药剂科， 江苏 常州213003； 2.常州四药制药有限公司研发中心， 江苏 常州213004）

克感额日敦片由栀子、苦参、土木香、诃子、悬钩子木、川楝子、山柰7 味药材加工而成，主要用于瘟病初期、感冒发烧、咳嗽、全身酸痛、头痛、咽喉肿痛、胸胁刺痛等临床病症的治疗，但现行质量标准［1］及文献［2⁃5］仅对其所含单一成分进行定量分析。中药制剂组成复杂，有效成分繁多，多种成分协同发挥作用以达到临床疗效，故仅检测单一成分难以对其质量进行全面评价，但传统多指标成分控制方法存在对照品用量大、质量不稳定、不易获得、价格昂贵等不足。

一测多评法利用中药有效成分之间存在的内在函数和比例关系，有效地解决了上述难题，同时该方法不仅普遍用于同类型成分的同时测定，在不同类型成分中也逐步得到应用［6⁃9］。因此，本实验采用一测多评法，以栀子苷为内标，建立栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、异土木香内酯、土木香内酯的相对校正因子，测定克感额日敦片中上述成分含有量，以期为该制剂全面质量控制提供新的方法和思路。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；LC⁃20AD 型高效 液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；CP225D 型电子天平（德国Sarto⁃rius 公司）；KQ⁃500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。土木香内酯（批号110760⁃201811，纯 度99.4%）、异土木 香内酯（批 号110761⁃201806，纯 度97.4%）、栀子苷（批 号110749⁃201919，纯度97.1%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。栀子新苷（批号CFS201901，纯度98.0%）、苦参醇I（批号CFS201702，纯度98.0%）对照品均购自武汉天植生物技术有限公司；羟异栀子苷（批号17101622，纯度99.1%）、京尼平龙胆双糖苷（批号18030422，纯度98.4%）、苦参酮（批号18060822，纯度97.7%）、槐属二氢黄酮G（批号18060622，纯度99.7%）对照品均购自上海同田生物技术股份有限公司。克感额日敦片（每片重0.25 g，批号34181003、34181106、34190205）购自内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、异土木香内酯、土木香内酯对照品适量，甲醇制成各成分质量分数分别为0.232、0.898、1.634、2.982、0.454、1.876、0.412、0.998、1.766 mg／g 的贮备液，各精密吸取2.5 mL，甲醇稀释，即得（各成分质量分数分别 为 11.6、44.9、81.7、149.1、22.7、93.8、20.6、49.9、88.3 μg／g）。

2.1.2 供试品溶液 取片剂适量，除去薄膜衣后研细，精密称取0.4 g，精密加入25 mL 甲醇［10⁃11］，密塞，称定质量，超声处理60 min［10⁃11］，放 冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按片剂处方工艺，分别制备缺栀子、缺苦参、缺土木香的阴性样品，按“2.1.2” 项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Agilent ZORBZX SB⁃C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0～10.0 min，9.0%A；10.0～29.0 min，9.0%～35.0% A；29.0～51.0 min，35.0%～52.0% A；51.0～65.0 min，52.0%～60.0%A；65.0～75.0 min，60.0%～9.0%A）；体积流量0.9 mL／min；柱温30 ℃；检测波长238 nm（0～29.0 min，栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷）［12⁃14］、295 nm（29.0～51.0 min，苦参醇I、苦参酮、槐属二 氢黄酮G）［15］、220 nm（51.0～75.0 min，异土木香内酯、土木香内酯）［16］；进样量10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰峰形对称，分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分计均不低于4 000，色谱图基线平稳，阴性无干扰。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.1.1” 项下贮备液适量，甲醇制成20 倍质量浓度差的对照品溶液Ⅰ～Ⅵ，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.1.1” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、异土木香内酯、土木香内酯峰面积RSD 分别为1.26%、0.93%、0.57%、0.55%、1.17%、0.96%、1.22%、1.01%、0.63%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重复性试验 取同一批片剂，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、异土木香内酯、土木香内酯含有量RSD 分别为1.58%、1.25%、0.96%、0.89%、1.38%、1.14%、1.61%、1.37%、0.99%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取新配供试品溶液1 份，于0、2、4、6、10、12 h 在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、异土木香内酯、土木香内酯峰面积RSD 分别为1.23%、1.01%、0.61%、0.59%、1.22%、0.94%、1.18%、0.97%、0.70%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含有量已知的同一批片剂，除去薄膜衣后研细，精密称取9 份，每份0.2 g，精密加入对照品溶液（栀子新苷0.128 mg／mL、羟异栀子苷0.506 mg／mL、京尼平龙胆双糖苷0.932 mg／mL、栀子苷1.966 mg／mL、苦参醇I 0.302 mg／mL、苦参酮1.194 mg／mL、槐属二氢黄酮 G 0.238 mg／mL、异土木 香内酯0.682 mg／mL、土木香内酯1.126 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算加样回收率。结果，栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、异土木香内酯、土木香内酯平均加样回收率（RSD）分别为96.94%（1.26%）、99.13%（1.42%）、98.96%（0.99%）、99.37%（0.86%）、97.92%（1.50%）、100.00%（0.76%）、98.67%（0.90%）、98.99%（0.84%）、97.86%（1.00%）。

2.4 相对校正因子测定 精密吸取“2.3.2” 项下对照品溶液Ⅰ～Ⅵ，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以栀子苷为内标，计算其他8 种成分的相对校正因 子fk／s，公式为fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck为其他成分含有量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含有量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性试验

2.5.1 仪器、色谱柱 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，考察Agilent 1200、LC⁃20AD 色谱仪，以 及 Agilent ZORBZX SB⁃C18、Waters Symmetry C1、Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响（RSD＜3%）。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 体积流量 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，考察体积流量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL／min 对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜3%）。

表4 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.6 色谱峰定位 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，以栀子苷为内标，采用相对保留时间法对色谱峰进行定位，结果见表5。

2.7 样品含有量测定 取3 批片剂，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法测定含有量，结果见表6。由此可知，2 种方法所得结果接近，相对平均偏差（RAD）均小于3%。

表5 各成分相对保留时间Tab.5 Relative retention time of various constituents

表6 各成分含有量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分筛选 在克感额日敦片中，君药栀子的主要成分为栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷等环烯醚萜，臣药苦参的主要成分为苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G 等异戊烯基黄酮，佐药土木香的主要成分为土木香内酯、异土木香内酯等倍半萜内酯。参考中药质量标志物确定原则，本实验选取上述9 种成分作为指标进行检测。

3.2 色谱峰定位方法筛选 本实验分别采用相对保留时间法、保留时间差法定位色谱峰，发现后者在不同仪器、色谱柱下测得的RSD 明显高于前者。因此，选择相对保留时间法进行定位。

3.3 供试品溶液制备方法筛选 本实验比较了提取溶 剂（甲 醇［10⁃11，15］、70% 甲 醇［13］、95% 乙 醇、70%乙醇［12，16］），发现甲醇提取时杂质干扰较小，各成分提取充分；比较了提取方式（超声［10⁃16］、加热回流），发现加热回流提取时杂质干扰严重；比较了 提取时 间（45 min［11］、60 min［15］、90 min），发现苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G提取60、90 min 时的效果差异不大，但明显高于45 min，可能与克感额日敦片中苦参采用细粉直接入药方式有关。最终确定，供试品溶液制备方法为甲醇超声提取60 min。

3.4 检测波长筛选 本实验采用二极管阵列检测器，在190～400 nm 范围内进行全波长扫描，发现栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷在238 nm 处有较大吸收，苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G 在291～297 nm 处有较大吸收，异土木香内酯、土木香内酯在190～220 nm 处有较大吸收。为了避免末端吸收对检测结果的影响，结合文献［12⁃16］，本实验选择220、238、295 nm，同时发现单一波长难以对克感额日敦片中9 种成分同时进行测定，故采用“2.2” 项下多波长切换模式。

4 结论

本实验首次采用一测多评法同时测定克感额日敦片中栀子新苷、羟异栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、苦参醇I、苦参酮、槐属二氢黄酮G、异土木香内酯、土木香内酯的含有量，该方法简便准确，可大大降低检验成本，为该制剂全面质量控制提供新的方法和思路。