外泌体在肝细胞癌中的作用

姚韵婷， 周远忠， 刘 俊

遵义医科大学公共卫生学院， 贵州 遵义 550004

目前关于外泌体的功能已经被越来越多的学者关注，大部分细胞中均可分泌外泌体。在肝脏中，外泌体来源于3种细胞：肝细胞、非实质免疫细胞[如Kupffer细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞]和非实质肝细胞(如肝星状细胞)，作为细胞外卵泡的一个亚型，外泌体参与许多正常和病理过程，尤其对于肿瘤发生发展的调控作用[1]。外泌体通过调节细胞外通讯，在肿瘤的耐药性、血管生成、上皮-间充质转变(EMT)和转移中发挥重要作用[2]。一方面，肿瘤细胞通过外源体冲击相邻细胞，建立致瘤微环境；另一方面，基质细胞[如肝星状细胞和间充质干细胞(MSC)]和免疫细胞可以影响肿瘤细胞，通过外泌体促进或预防肿瘤发生[3]。尤为重要的是，外泌体的多功能作用主要由它们的供体细胞和它们的含量决定，包括脂质、核酸和蛋白质(图1)[4]。此外，外泌体由于其众多特征而具有治疗工具的潜力，本文将对此进行综述分析。

1 外泌体合成

近年来，外泌体作为肿瘤发生的主要调控因子引起学者的极大关注。最新研究[5]显示，外泌体产生的主要机制为转运所需的内吞体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)(图2)， 并将其首次定义为酵母中的泛素依赖性蛋白质分拣途径。Vps-4是ESCRT复合物的组合物之一，被称为具有ATP结合结构域的多聚体机械酶，其结合ESCRT-Ⅲ亚基然后通过ATP脱水以使它们与细胞膜解离而提供能量[6]。Wei等[7]发现，Vps-4的下调是影响肝细胞癌(HCC)患者无复发生存的独立危险因素，研究表明，Vps-4A与抑制HCC细胞衍生的外泌体生物活性和受体细胞对外泌体的反应有关，其中PI3K/Akt信号通路可能是一种候选机制。这项研究让学者认识到外泌体的产生与肿瘤的进展、转移和不良预后有关。

2 外泌体转运物质

据报道[8]，与非癌细胞相比，癌细胞产生和分泌大量外泌体作为肿瘤诱导剂。其中外泌体在操纵肿瘤细胞微环境中起关键作用。重要的是，证实了外泌体的功能主要通过所转运的物质所确定，在不同情况下发挥不同功能。因此，笔者总结了HCC患者外泌体中发现的分子，包括蛋白质和RNA[miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)]，目的是阐明外泌体促进HCC进展的机制。

2.1 蛋白质 根据Vesiclepedia数据库，外泌体中蛋白质的数量约为1800种，而在HCC细胞系衍生的外泌体中，通过质谱分析发现了213种独特的蛋白质[9]。外泌体蛋白包括货物蛋白和膜蛋白，具体取决于外泌体中的位置[10]。研究[11]显示，在肿瘤的不同进展期，外泌体中的货物蛋白质组成是不同的。

2.2 核酸 考虑到肝活检是监测和评估肝脏疾病的金标准，但是其具有出血和感染的风险，因此迫切需要寻求非侵入性诊断工具[12]。因此，“液体活检”成为目前研究的焦点，“液体活检”是通过血清外泌体的检查，实现HCC的早期诊断和预后预测[13]。在HCC外泌体中，除蛋白质外，已经证明[14]检出核酸，特别是miRNA，也是外泌体的组合物之一(表1)。Kogure等[23]已经证实了在Hep3B分泌的外泌体中，共有134种miRNAs表达，与其供体细胞相比较，其中11种miRNAs为Hep3B特殊表达的miRNA。Li等[24]报道，miR-429是HCC的重要预后因子，被分泌到外泌体中并被受体细胞摄取。Sohn等[25]比较了HCC、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)患者血清中外泌体miRNA的水平，结果显示，与CHB相比，HCC患者中miR-18a、miR-221和miR-222的表达水平显著更高，miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195的表达水平更低。这些研究显示，外泌体转运物质中miRNA可能成为HCC诊断和预后预测的潜在生物标志物。在HCC中发现的miRNA见表1。

Sugimachi等[22]已经证明miR-718可以作为预测手术后HCC复发的术前生物标志物，肝移植术后HCC复发患者外泌体中miR-718的表达水平显著低于无HCC复发的患者。此外，经验证的队列研究[26-27]表明，miR-718的表达降低和潜在靶基因HOXB8的过表达与肿瘤侵袭性和不良预后相关。另外，Liu等[20]报道，在HCC患者中，外泌体miR-125b可作为患者预后标志物，是HCC患者复发时间以及总体存活的独立因素。

尽管目前研究[15]证实外泌体中miRNA表达可能是反映供体细胞特征的有用工具，可能成为肿瘤发生发展及预后的潜在生物标志物，但目前外泌体miRNA在HCC发生发展中的作用仍知之甚少。此外，miRNA表达水平和功能在特定条件下存在争议，一些队列研究不包括健康参与者，因为与健康人相比，从肝病患者中收集血清样本更具便利性[28]。

最新研究[29]集中在除miRNA之外的lncRNA在外泌体中的作用。lncRNA定义为长度超过200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA-ROR和lncRNA-LVDR其在HCC衍生的外泌体中被检出。最近研究[30]发现，与供体细胞相比，lncRNA在细胞外囊泡的表达更为保守。例如，被命名为TUC339的lncRNA在HCC细胞衍生的外泌体中被检出，并认为其具有促进HCC生长以及扩散的功能[25]。最重要的是，这些研究探索了通过外泌体在细胞内转移的核酸，具有调节肿瘤细胞并起到细胞内信号传导介质的作用[31]。

3 外泌体与受体细胞相互作用的机制

近年来，学者广泛研究了受体细胞对外泌体摄取的动态调节[32]。有几种模型被认为是受体细胞外泌体内化的可能机制，包括受体介导的内吞作用和经典的液相内吞作用(图3)[33]，后者被认为是缺乏特异性的微泡内化的常用方法。

相反，受体介导的胞吞作用由于其具有细胞特异性而引发学者的兴趣，使得外泌体进一步修饰后用于治疗成为可能[34]。整合素是外泌体膜上常见的受体之一，已经发现外泌体整联蛋白具有预测转移器官的能力。例如，外泌体表达人整合素αvβ5(human integrin αvβ5，ITGαvβ5)特异性地结合到Kupffer细胞，介导肝脏趋向性，而外泌体ITGα6β4和ITGα6β1结合肺成纤维细胞和上皮细胞，介导肺脏趋向性[35]。因此，通过外泌体整合有助于肿瘤转移的预防。

表1 HCC外泌体中发现的miRNAs

此外，封闭清道夫受体A类家族(SR-A)，作为一种新的外泌体单核细胞/巨噬细胞摄取受体，体内含硫酸葡聚糖，通过小鼠肝脏中的外泌体清除来增强肿瘤积聚[36]。这些发现是使外泌体肿瘤治疗成为可能。

值得关注的是，摄取外泌体的过程并不总是调节受体细胞功能所必需的；同时它是运输外泌体物质的基础。Muller等[37]表明，肿瘤来源的外泌体介导调节性T淋巴细胞抑制因子功能依赖于细胞表面信号传导，并且不需要受体细胞进行外泌体内化。

此外，从癌症患者血清中分离的外泌体观察到受体细胞的致癌转化。并与受体细胞中肿瘤抑制基因突变现象具有协同作用。总的来说，这些结果提示了肿瘤细胞的转移可能不是必要的转移，可以通过外泌体运输来实现。

4 外泌体在HCC进展中的作用

由于肝脏是一个多细胞器器官，细胞间通讯在肝脏生理学和病理学中是必不可少的，包括肿瘤发生[38]。除自分泌、旁分泌和细胞-细胞接触外，外泌体提供新的细胞间通讯形式[39]。该过程可能受许多因素的影响，如微环境pH、致癌转化和应激反应。外泌体在HCC进展中的作用已得到广泛研究。源自HCC细胞的外泌体miRNA激活TGFβ激酶1和下游信号分子，导致受体细胞的进一步生长，表明外泌体具有调节受体细胞信号传导和生物效应的能力[18]。

4.1 外泌体参与HCC化疗耐药 索拉非尼是美国食品药品监督管理局批准的用于晚期HCC的一线分子靶向药物[40]。然而，在长期索拉非尼治疗后，HCC细胞表现出对索拉非尼的抗性。越来越多的证据[41]表明，外泌体也参与了HCC的化学抗性。

首先，外泌体促进药物外排以产生化学抗性，肿瘤细胞可以通过外泌体包裹来外排抗癌药物和代谢物。Safaei等[42]发现，lncRNA-LVVDL在HCC细胞中的表达在不同的抗肿瘤药物包括索拉非尼的存在下增加。此外，在HCC细胞衍生的外泌体中也发现了lncRNA-LVVDL的过表达，表明癌细胞不仅经由外泌体消除化学药物，而且通过诱导分子转移来维持化学抗性[43]。

其次，在化学药物存在下，外泌体通过增强肿瘤细胞的活力而参与化学抗性。Qu等[44]首次表明，源自HCC细胞的外泌体可抑制索拉非尼诱导的细胞凋亡，从而发挥索拉非尼抗性，其潜在的机制可能是HCC外泌体诱导肝细胞生长因子在HCC细胞中的过表达，并激活c-Met磷酸化和下游信号传导途径，例如PI3K/Akt和MAPK/Erk途径。Takahashi等[45]还发现，索拉非尼可增加HCC中lncRNA-ROR的表达，而lncRNA-ROR可选择性地富集外泌体以响应TGFβ，从而调节化疗诱导的细胞凋亡并允许细胞在化学治疗应激下通过p53依赖性方式存活。

这些结果表明，外泌体参与化学治疗反应调节，并提供可能成为HCC细胞化学敏感性治疗的靶点。

4.2 外泌体调节肿瘤细胞的EMT EMT是癌症远处转移的最初步骤，肿瘤细胞的迁移和侵袭通过EMT过程实现，从而导致癌症的转移[46]。外泌体的出现为EMT的研究提供了新的视角。例如，已经发现在从多形核白细胞衍生的外泌体接收miR-223后，在癌细胞中可出现EMT重编程[47]。然而，miR-223的这种影响是短暂的，因为它迅速被核酸外切酶失活XRN1，表明异位miRNA和内源性的miRNA以不同的方式行动[48]。此外，已发现MSC衍生的外泌体在许多不同癌症类型的相邻上皮细胞中诱导EMT。

总之，这些结果支持外泌体参与EMT的观点，并与癌细胞侵袭、转移有关[19]。然而，需要更多的研究来更好地理解外泌体调节HCC中EMT的确切机制。

4.3 外泌体促进HCC组织中的血管生成 已经证明经历EMT的癌细胞能够通过外泌体有效地将血管生成蛋白转移到受体内皮细胞。此外，外泌体在严峻条件，如氧或营养缺失，化疗药物刺激和乙醇暴露下，在HCC组织中分泌增加[49]。其中，氧气和营养缺乏是血管生成的主要原因。这些结果使研究者假设在严峻条件下，癌细胞通过外泌体传递血管生成分子以建立促进肿瘤的微环境[16]。在由Gonzalez-King进行的研究中，显示缺氧的MSC衍生的外泌体通过水平转移Jagged-1并激活内皮细胞中的下游Notch途径诱导血管生成[50]。Sruthi等[21]研究发现，HepG2细胞在细胞质低氧条件下外泌体miR-23a下调，受体细胞SITR1表达处于较高水平并促进外泌体分泌，从而诱导血管生成。

越来越多的证据表明肿瘤微环境中确实像存在癌症干细胞(cancer stem cell，CSC)和血管生成之间的关系，称为“串扰”，其协同促进肿瘤生长[51]。例如，Morrow等[52]表明，CD90+CSC等干细胞可通过外泌体影响上皮细胞。在外泌体内化后，在上皮细胞中观察到血管内皮生长因子产生和形成的水平增加。通过鉴定lncRNA谱，发现lncRNA H19富含CD90+CSC类似于肝细胞衍生的外泌体，并且可以是血管生成的主要介质和HCC的治疗靶点[53]。

除细胞内环境外，外源刺激如乙醇暴露等多种途径均可诱导血管生成内皮表型。Lamichhane等[17]报道乙醇通过下调抗血管生成miRNA(miR-106b)和上调促血管生成的lncRNA(肺癌转移相关转录本1和HOX转录反义RNA)来增加内皮细胞衍生的血管生物活性。重要的是，这可能是乙醇引起HCC的分子机制之一。

4.4 外泌体促进HCC转移 由于HCC的高转移率和高术后复发率，HCC的长期生存率较低。肿瘤转移是一个多步骤的过程，包括侵入、血管转移,并通过循环系统远端部位的定植。上面已经描述了转移的最初步骤。

目前研究发现，无论是来源于癌细胞的外泌体或邻近的基质细胞外泌体，均具有促进肿瘤细胞转移的作用。各种致癌RNA和蛋白质，如MET原癌基因、caveolins和S100的家庭成员，均在HCC细胞系来源的外泌体转录组和蛋白质组被发现[54]。肝细胞对这些外泌体的内化激活PI3K/AKT和MAPK信号传导途径，并增加有利于细胞侵袭的基质降解蛋白酶MMP-2和MMP-9。此外，Zhang等[55]研究证明，HCC相关成纤维细胞衍生的外泌体miR-320a表达降低，导致造血相互作用蛋白在受体细胞失调，从而引起癌细胞肺转移。结果表明，外泌体可动员正常肝细胞从而构建致癌微环境，最终引发肿瘤细胞转移。

4.5 外泌体引发免疫反应 免疫耐受是肝脏独特的免疫微环境，是治疗HCC免疫治疗的主要障碍。外泌体引发免疫反应是矛盾的。一方面，外泌体存在于多种已知的免疫抑制机制中，例如免疫抑制细胞的激活，抗原递呈缺陷和T淋巴细胞凋亡的诱导。另一方面，外泌体是由肿瘤细胞和免疫细胞暴露肿瘤抗原的主要来源。例如，Zhang等[56]证明了抗癌药物刺激HCC衍生的外泌体分泌并产生更多的外泌体携带热休克蛋白，其被称为“应激反应”蛋白。根据上述研究，携带热休克蛋白的外泌体可通过多种机制刺激有效的抗肿瘤免疫反应，同时刺激NK细胞细胞毒性颗粒酶B的产生，上调抑制性受体CD94的表达，下调活化受体CD69、NKG2D和NKp44的表达。

Deng等[57]比较了由HCC细胞衍生的外泌体引发的免疫应答水平，研究表明，在用HCC TEX脉冲的树突状细胞(DC)处理的HCC小鼠中观察到T淋巴细胞数量增加，IFNγ表达增加，IL-10和肿瘤生长因子β水平降低。这些结果表明，外泌体携带肿瘤相关抗原呈现给DC，并引发DC介导的免疫应答。

此外，Lu等[58]证明，在用HCC抗原修饰的DC(AFP-表达DC)衍生的外泌体处理的HCC小鼠中观察到有效的T淋巴细胞活化。这些发现表明外泌体不仅将肿瘤相关抗原从肿瘤细胞递呈给抗原递呈细胞，而且还能够将它们递呈给引起抗原介导的抗肿瘤免疫应答的T淋巴细胞，这为无细胞疫苗极大地促进了HCC免疫疗法的发展。

有研究认为，在细胞营养缺乏条件下外泌体的分泌与正常状况有所不同，可能由于营养缺乏对免疫功能的影响引起外泌体分泌条件的改变，进而进一步诱发后续的连锁反应而影响患者预后。 外泌体在细胞营养缺乏和营养条件正常情况下的分泌有所不同，考虑是因营养缺乏对免疫功能影响，而外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。来自美国莱斯大学等多个研究单位的研究人员共同揭示了肿瘤微环境通过外泌体为癌细胞提供营养物质帮助癌细胞度过营养匮乏等情况的新机制。CAF来源的外泌体(CDEs)抑制了线粒体氧化磷酸化,因此增加了糖酵解和谷氨酰胺依赖的还原羧化作用, 外泌体提供氨基酸给营养被剥夺的癌细胞，采用一种类似巨吞的机制。利用外泌体导入机制，作者提供了足够充足的证据，CDEs包含完整的代谢产物，包含氨基酸、脂质和三羧酸循环中间体，这些被癌细胞如饥似渴地利用，在营养缺乏和压力环境下帮助肿瘤成长。

另一方面可能是因为外泌体操纵肿瘤微环境的另一个例子是诱导血管生成。血管生成是利用已存在的血管形成血管的自然过程，在生物体的生长发育过程中以及对损伤的反应中很常见。然而，这一过程在癌症进展中也是必不可少的，因为肿瘤生长需要血管系统的快速形成来提供营养、氧气和废物的清除。当肿瘤微环境是缺氧状态时，会促进细胞外胞囊的形成与释放，改变细胞外胞囊的含量与组成，从而激活内皮细胞，刺激血管形成，帮助肿瘤克服氧气及营养的缺乏环境，以至于促进诸如转移的肿瘤进程。研究发现外泌体通过miRNA、mRNA和蛋白质的递送在血管生成中发挥重要作用。例如，有研究[59-60]报道白血病细胞来源的外泌体过表达miR-92a(即一种属于miR-17-92簇的miRNA)进入内皮细胞，并导致迁移和血管生成的增强。此外，Delta-like 4(Dll4)是一种膜结合的Notch配体，在血管发育和血管生成中起着重要作用，可以被外泌体通过3D胶原基质转运到远处的细胞。研究表明肿瘤微环境内的癌症相关成纤维细胞能够通过分泌外泌体为癌细胞提供氨基酸等营养物质，这表明靶向癌症相关成纤维细胞或可成为新的癌症治疗方向，除此之外未来或还可以利用外泌体进行药物输送达到癌症治疗的目的。但关于机体营养对外泌体分泌的影响，还需要深入的研究分析。

4.6 外泌体是一种很有前途的抗癌治疗药物 细胞膜衍生的纳米颗粒具有保护其载物、免疫原性低、通过内皮形成适当尺寸等特点，可作为药物传递剂。例如，Yu等[61]报道了脂肪来源的MSC具有经由外泌体转移的miR-122，由此加强HCC细胞对化学治疗剂的敏感性。有研究[62]已经证明，miR-122负调节的去整合素以及金属蛋白酶家族成员17(adisintegrinandmetalloproteinase 17，ADAM17)、ADAM10、IGF1R和MADS-box转录因子SRF，与HCC患者预后差、肿瘤转移有关。

由于MSC是细胞最常见的外源性外泌体生产者之一，被学者广泛关注。除了脂肪源性MSC，117种骨髓来源的外泌体常用于干细胞的治疗中。此外，报道显示，DC衍生的外泌体可用作癌症疫苗。Yukawa等[63]提出，通过靶向用于药物递送囊泡配体进行外泌体修饰，具有着潜在的临床应用价值。例如，用Arg-Gly-Asp(RGD)肽修饰外泌体膜可引发血管靶向作用，这可能是治疗性血管生成的新方向。同时，据报道外泌体参与了抗化疗药物抗性，并且一些研究表明抑制外泌体分泌在使癌细胞对治疗药物敏感方面是有效的。总之，外泌体是HCC治疗的新方向。

5 结论

恶性肿瘤与外泌体之间的关系一直是过去几年的一个研究热点。此综述阐述了目前HCC发生发展中与外泌体的关系。目前研究认为，外泌体通过多种致瘤过程促进HCC进展，包括化学抗性、EMT、血管生成、肿瘤转移以及免疫应答。外泌体作为HCC药物递送剂，有望成为HCC治疗的新方向。这些发现为探索HCC的新治疗工具提供了框架。然而，由于缺乏关于外泌体的临床安全性和功效的信息，研究受到限制。因此，还需要进一步的研究以更好地了解外源体与HCC发展的关系。

作者贡献声明：姚韵婷等负责课题设计，资料分析，撰写论文；周远忠等参与收集数据，修改论文；刘俊等负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。