三阴性乳腺癌JMJD3和PTEN的表达与临床病理特征的关系

徐小艳 王建君 闫琛 李川 杨金花

郑州人民医院病理科（郑州450000）

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一种特殊的临床病理类型，约占浸润性乳腺癌的20%，临床上具有侵袭性强、预后差的特点，其对内分泌和靶向治疗均不敏感，缺乏有效的个体化治疗方法［1-2］。三阴性乳腺癌预后相关分子指标成为研究的焦点。JMJD3 又称赖氨酸去甲基化酶6B（lysine demethylase 6B，KDM6B），其异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，被认为是具有潜在应用价值的肿瘤评估指标之一。前期的研究结果表明JMJD3 在乳腺癌发生、发展中扮演重要角色，其在正常组织中高表达，浸润性癌组织中低表达，但并未进一步观察JMJD3 在三阴性乳腺癌中的表达特点。10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）基因被认为是一种与肿瘤发生关系密切的抑癌基因，与乳腺癌的发生、发展和预后密切相关。本研究旨在探讨JMJD3 与PTEN在TNBC 中的表达及其与临床病理特征和预后的关系，并分析二者的相关性，为TNBC 靶向治疗提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年1月至2015年12月在郑州人民医院乳腺外科行手术治疗、术后经病理确诊且病历完整的患者作为研究对象。研究样本为87 例三阴性乳腺癌和80 例非三阴性乳腺癌病理活检标，选取距三阴性乳腺癌肿物1 cm 处相对应的癌旁组织作为对照。按照2012年WHO 乳腺癌组织病理分级分类法，对其进行分组。有完整5年随访资料的患者83 例，患者无病生存期从手术之日开始计算，终止日期为肿瘤复发日期或末次随访日。所有标本均经10%的甲醛固定，石蜡包埋，并经郑州人民医院病理科诊断确诊。

1.2 主要试剂JMJD3 一抗兔抗人多克隆抗体公司购自Abcam，PTEN 一抗兔抗人单克隆抗体、二抗及二氨基联苯胺（DAB）均为福州迈新公司。

1.3 免疫组织化学染色主要步骤如下：（1）石蜡组织切片、烤片、脱蜡并水化；（2）抗原修复；（3）一抗37 ℃孵育2 h；（4）二抗37 ℃孵育20～30 min；（5）DAB 显色5～10 min；（6）脱水、透明和封片。用已知JMJD3 和PTEN 阳性的乳腺癌组织和PBS分别代替一抗作为阳性和空白对照。

1.4 免疫组化结果判断根据染色强度和染色细胞所占百分比进行评分，半定量判定：低表达包括：（1）阴性即无阳性着色；（2）弱阳性（+或者++，细胞着色范围＜30%）；高表达包括：（1）中等强度阳性（++，细胞着色范围≥30%或者+++，细胞着色范围＜50%）；（2）强阳性（+++，细胞着色范围≥50%）。本研究中阳性表达率=高表达样本量/总样本含量，免疫组化的判读有两位高年资病理医师采用双盲法进行判读。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理与统计分析JMJD3 和PTEN 阳性表达率和病理因素的相关性采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier 法，并以Log-rank 法检验。二者的相关性采用Spearman 相关分析，检验水准α=0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 JMJD3和PTEN在癌旁组织、非三阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌中的表达免疫组化显示JMJD3 主要定位于细胞核，呈棕褐色，87 例三阴性乳腺癌JMJD3 的阳性表达率34.48%（30/87）明显低于相对应癌旁组织74.71%（65/87）和非三阴性乳腺癌组织75.00%（60/80），差异有统计学意义（χ2=39.191，P＜0.001）。PTEN 主要定位于细胞浆，呈棕褐色，87 例三阴性乳腺癌中，PTEN 的阳性表达表达率40.23%（35/87）明显低于相对应癌旁组织68.97%（60/87）和非三阴性乳腺癌组织72.50%（58/80），差异有统计学意义（χ2=22.329，P＜0.001）。JMJD3、PTEN 在非三阴性乳腺癌和癌旁组织中表达率基本相似，差异无统计学意义。见图1，表1。

表1 癌旁组织、非三阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌中JMJD3和PTEN 的表达Tab.1 Expression of JMJD3，and PTEN in adjacent tissues，TNBC and non TNBC 例（%）

图1 JMJD3 和PTEN 在癌旁组织、非三阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌中的表达，免疫组织化学（物镜200×）Fig.1 Expression of JMJD3 and PTEN in paracancerous tissue，non three negative breast cancer and three negative breast cancer，immunohistochemistry（objective 200×）

2.2 JMJD3 和PTEN 分别与三阴性乳腺癌临床病理特征的关系87 例三阴性乳腺癌中，JMJD3 与组织学分级有关，即JMJD3 在高分化中的表达率76.00%（19/25）高于中-低分化17.74%（11/62），差异有统计学意义（χ2=27.765，P＜0.001）；JMJD3 在有淋巴结转移中13.33%（6/45）低于无淋巴结转移57.14%（24/42），差异有统计学意义（χ2=18.455，P＜0.001）；JMJD3 与TNM 分期有关，其在TNMⅠ期、Ⅱ期组别66.67%（20/30）高于Ⅲ期、Ⅳ期组别17.54%（10/57），差异具有统计学意义（χ2=20.994，P＜0.001）。JMJD3 与乳腺癌患者年龄、肿瘤位置及肿瘤直径均无关（均P＞0.05）。见表2。

87 例乳腺浸润性导管癌中，PTEN 在高分化中的表达率76.00%（19/25）高于中-低分化25.81%（16/62），差异具有统计学意义（χ2=18.667，P＜0.001）；其在淋巴结有转移组别中22.22%（10/45）低于无淋巴结转移组别59.52%（25/42），差异有统计学意义（χ2=12.571，P＜0.001）；其在TNMⅠ期、Ⅱ期组别70.00%（21/30）高于Ⅲ期、Ⅳ期组别24.56%（14/57），差异有统计学意义（χ2=16.877，P＜0.001）。PTEN 与乳腺癌患者年龄、肿瘤位置和肿瘤直径均无关（均P＞0.05）。见表2。

表2 三阴性乳腺癌组织中JMJD3和PTEN的表达与临床病理参数特征的关系Tab.2 Relationship between expression of JMJD3 and PTEN with clinicopathological characteristics of TNBC

2.3 三阴性乳腺癌中JMJD3和PTEN的相关性87例三阴性乳腺癌组织中，JMJD3和PTEN同时高表达者23例（26.44%），同时低表达者45例（51.72%），仅JMJD3 表达高表达者7 例（8.05%），仅PTEN 表达高表达者12 例（13.79%）。采用Spearman 相关分析，结果显示JMJD3 和PTEN 表达呈正相关，差异有统计学意义（R=0.539，P＜0.001）。见表3。

表3 三阴性乳腺癌中JMJD3 和PTEN 的相关分析Tab.3 Spearman analysis of JMJD3 and PTEN in TNBC

2.4 JMJD3 和PTEN 蛋白表达与乳腺癌患者无病生存期的关系83 例三阴性乳腺癌患者5年总体无病生存率为49.0%（19/83）。JMJD3蛋白高表达者的无病生存率86.7%（26/30）高于低表达者43.4%（23/53），经Log-rank 时序检验，两组差异有统计学意义（χ2=18.832，P＜0.001）。PTEN 蛋白高表达者无病生存率82.9%（29/35）高于低表达者41.7%（20/48），经Log-rank 时序检验，两组差异均有统计学意义（χ2=20.783，P＜0.001）。JMJD3 和PTEN 共同高表达、单一指标高表达、二者均低表达无病生存率依次下降分别为87.5%（21/24）、75%（12/16）、37.2%（15/43），经Log-rank 时序检验，三组差异均有统计学意义（χ2=28.933，P＜0.001）。见图2。

3 讨论

TNBC 是一组高度异质性的恶性肿瘤，其组织学特点是肿瘤细胞核异型性明显，核分裂象易见，分化较差，大部分组织学级别高，具有侵袭性强、易复发和转移等特点，对内分泌治疗和靶向治疗均不敏感，治疗较其他类型的乳腺癌更为困难，仅有15%～20%的TNBC 患者对化疗敏感［3］，5年生存率较低［4］。因此，TNBC 患者迫切需要新的治疗方法来改善预后，对三阴性乳腺癌相关分子研究引起越来越多的重视。

图2 JMJD3 和PTEN 蛋白的表达与三阴性乳腺癌患者无病生存期的关系Fig.2 Expression of JMJD3 and PTEN protein and disease-free survival of triple negative breast cancer patients

JMJD3 编码基因位于人类第17 号染色体上。研究发现，JMJD3 作为一种赖氨酸27 位点三甲基化组蛋白H3 去甲基化酶（histone H3 methylated Lys27，H3K27me3），其异常表达与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关［5-6］，JMJD3 在肿瘤发生发展过程中扮演促癌基因或者抑癌基因角色，报道不一。国内有研究表明［7］JMJD3 表达降低可能促进肺癌的发生发展。在胃癌中JMJD3 低表达对胃癌细胞的增殖具有抑制作用，对细胞凋亡具有促进作用［8］。上述研究均表明JMJD3 在肿瘤中扮演抑癌基因角色。但是，部分研究表明JMJD3 在肿瘤中扮演促癌基因角色，研究发现［9］胶质母细胞瘤中JMJD3 表达高于正常脑组织，JMJD3 抑制剂能够诱导胶质瘤细胞凋亡，抑制细胞迁移。张陪陪［10］研究表明在肝癌细胞中转染入JMJD3 的干扰质粒后，肝癌细胞的生长、增殖、侵袭能力均降低。

有关JMJD3 在乳腺癌组织中表达规律的研究，前期研究［11］结果显示JMJD3 在乳腺浸润性导管癌组织表达水平较癌旁组织低，JMJD3 蛋白在组织学分化差、淋巴结转移及较高TNM 分期中表达率减低，JMJD3 在乳腺癌中扮演了抑癌基因的角色，其在三阴性乳腺癌表达减低，但是前期研究尚未进一步观察JMJD3 在三阴性乳腺癌中表达与临床病理特征和预后的关系。本研究结果表明JMJD3 在三阴性乳腺癌表达减低，其在乳腺癌旁组织和非三阴性乳腺癌中表达较高。JMJD3 在三阴性乳腺癌组织学分化差、淋巴结有转移及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期表达减低，其表达越低，患者无病生存期越短。有研究表明JMJD3 家族去甲基化酶是通过参与性激素受体的信号转导来发挥其生理功能的，在女性乳腺癌细胞中JMJD3 表达明显增加［12］，这也能够解释在三阴性乳腺癌中JMJD3 表达减低的原因。本研究结果显示肿物直径越大，JMJD3 表达率越低，但差异却无统计学意义，可能跟研究样本量有关。

PTEN 是一种重要的抑癌基因，表达一种膜结合型脂质磷酸酶，能催化三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化，进而拮抗PI3K，最终抑制细胞生长并介导细胞凋亡［13］。目前已在多种肿瘤中发现存在PTEN基因的突变，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［14-16］，它能够负性调节细胞生长，诱导凋亡并抑制细胞浸润和转移［17-18］。本研究结果表明，三阴性乳腺癌组织中PTEN 蛋白的阳性表达率低于乳腺癌旁组织和非三阴性乳腺癌组织，其表达与乳腺癌的组织学分级、淋巴结转移、TNM 分期和预后有关，而PTEN 蛋白的表达与其他临床病理特征包括年龄、肿瘤部位、肿瘤直径均无关。以往文献［19］报道，PTEN 蛋白在三阴性乳腺癌中低表达，其表达与临床分期及淋巴结转移密切相关，而与组织学分级无关。笔者推测其原因如下：（1）跟样本含量有关；（2）免疫组织化学染色结果判读标准不同。孙志微等［20］研究表明PTEN 抑癌基因可通过抑制三阴性乳腺癌细胞FAK 磷酸化，抑制肿瘤细胞复制，进而抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭。PTEN 在三阴性乳腺癌中的具体作用机制尚需进一步研究。

本研究结果表明，JMJD3 和PTEN 在三阴性乳腺癌中表达均减低，扮演抑癌基因角色，二者均低表达患者预后更差，相关分析结果显示二者呈明显正相关关系，在三阴性乳腺癌的发生发展中可能存在协同作用。有关二者的相关性，国内外尚未见同类文献报道。值得注意的是，有研究表明JMJD3 能够通过NF-κB 信号通路调节肿瘤微环境，促进黑色素瘤的进展和转移［21］，NF-κB 信号转导通过miR-181a/PTEN 轴促进大肠癌细胞生长［22］，在结肠癌中PTEN 能够通过PI3K/AKT/NF-kB 途径抑制结肠癌的进展［23］。由此可见JMJD3 和PTEN涉及共同的信号通路，二者在三阴性乳腺癌中具体作用机制可以作为后续的进一步研究方向。

综上所述，JMJD3 和PTEN 的异常表达与三阴性乳腺癌的发生、发展密切相关，二者可能存在相关调控机制，本研究不仅为相关信号通路机制研究提供依据，而且提示对三阴性乳腺癌JMJD3 和PTEN 的检测有助于判断疾病的进展和预后，为寻找三阴性乳腺癌治疗靶标提供新的方向。