长期吸入低浓度七氟烷对雌性小鼠早期胚胎及妊娠结果的影响

舒蕤 张成明 丁国建

滨州医学院附属医院1麻醉科，2小儿外科（山东滨州256603）；3潍坊医学院麻醉学系（山东潍坊261053）

吸入麻醉药自应用于临床以来，手术室吸入麻醉药废气污染的问题就一直受到高度关注。七氟烷是近年来临床中最常用的吸入麻醉药［1］，同时也是手术中主要的麻醉废气之一，麻醉医师及护理人员长期暴露于低浓度七氟烷环境中。大量的流行病学研究资料表明，长期处于麻醉废气环境中的女性自然流产率和畸胎出生率都明显高于正常环境中的女性［2-3］。目前已有很多关于七氟烷器官毒性［4］和对学习记忆的影响［5］等方面研究，近年来也出现关于胚胎期母体暴露于七氟烷的相关研究，结果表明在胚胎发育时可对其神经系统［6-9］、听力［10］、学习及记忆力［11］等产生不良影响。长期暴露于低浓度七氟烷是否会降低卵子的质量，影响卵子受精、卵裂和胚胎着床等尚不明确。因此，本研究模拟长期暴露于七氟烷废气的工作环境，通过观察低浓度七氟烷对小鼠早期胚胎及妊娠结果的影响，探讨低浓度七氟烷对雌性小鼠生殖生理的影响，拟为临床安全用药、职业防护提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂6周龄SPF级雌性健康昆明小鼠，体质量（20±2）g（由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供，动物许可证号：SCXK鲁20080002）；小鼠分笼饲养1 周以适应环境，观察各组动物进食、活动、粪便、毛发等情况。饲养环境通风清洁，温度21～25 ℃，相对湿度45%～55%，明暗周期为12 h/12 h（8：00 开灯，20：00 关灯）。供给充足的饮水和全营养饲料。七氟烷购自上海恒瑞医药有限公司（产品批号：10122132）。本研究通过本院伦理委员会批准（审批号：20190125-02）。

1.2 实验方法6 周龄昆明雌性小鼠24 只，随机分为七氟醚组（A 组）和对照组（B 组）两组。性成熟雄性小鼠12 只，注意体质量均匀、单独饲养，实验前雄性小鼠长期禁欲。A 组每天持续吸入0.1%七氟烷6 h，B 组正常饲养。雄性小鼠正常饲养。30 d 后取发情期雌鼠与性成熟雄鼠2∶1 合笼，合笼第二日晨7 时观察雌鼠阴栓以确定是否受孕，发现阴栓者记为孕0.5 d。A、B 两组受孕小鼠再分别随机分为A1、A2、B1、B2 四个组。各组雌鼠维持原条件饲养。A1、B1 组分别在受孕小鼠孕3.5 d 时将其颈椎脱臼处死，用75%酒精喷洒小鼠，消毒后放置于实验台上，使用洁净纱布轻拭小鼠腹部，并用两只止血钳将腹部皮肤稍提起，向头尾两侧将其皮肤撕开，至一侧将其头包裹，一侧将其后肢包裹。左手使用镊子将腹膜提起，右手持剪刀剪开腹膜，使其平摊于解剖板上，将肠道翻向一侧腹膜，暴露一侧肾脏，在肾脏下方可以看到连有脂肪组织的该侧卵巢。夹住卵巢旁的脂肪将其轻轻提起，并钝性游离子宫，并取出子宫，用注射器将子宫内桑葚胚或囊胚阶段的胚胎冲出收集，倒置显微镜下观察形态。A2 和B2 组受孕小鼠孕18.5 d 时脱臼处死，取出含有胚胎的子宫，显微器械剖开子宫，进行子宫及胚胎的观察。在饲养过程中，同时观察受孕小鼠有无流产现象及其他异常。

1.3 监测指标A1 和B1 组孕早期桑甚胚或囊胚阶段胚胎的收集及镜检。A2 和B2 组检查胎鼠的体质量和身长。孕期雌性小鼠流产状况。

1.4 统计学方法所有数据使用SPSS 17.0 统计软件进行数据统计，符合正态分布计量数据用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 假孕现象A 组中2 只小鼠出现假孕现象（阴道内见阴栓，但解剖后未发现胚胎），B 组出现1 只。见图1。

图1 小鼠阴栓如图所示Fig.1 The vaginal plug of females

2.2 异常胚胎A 组1 只小鼠孕3.5 d 解剖发现子宫肿胀现象，且宫腔内未发现胚胎，B 组未发现此种现象；A 组孕3.5 d 出现异常胚胎，B 组未发现（图2）。

2.3 阴道流血A 组2 只出现阴道流血现象，解剖发现子宫内含有暗红色积血，B 组未发现。见图3、4。

2.4 异常胎盘A 组1 只出现异常胎盘，B 组未发现异常胚胎。见图5、6。

2.5 胚胎身长和体质量小鼠孕18.5 d 解剖得胚胎，A 组胚胎体质量低于B 组胚胎，差异有统计学意义（P＜0.05）；身长亦低于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组胎鼠身长体质量的比较Tab.1 Comparison of body length and weight of fetal rats in each group ±s

表1 各组胎鼠身长体质量的比较Tab.1 Comparison of body length and weight of fetal rats in each group ±s

注：A 组缺少数值者以本组平均值代替，A 组与B 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别/监测指标身长（cm）体质量（g）B 组2.97±0.55 1.72±0.60 A 组1.96±0.43△1.03±0.22△

图2 A、B 两组小鼠孕3.5 d 子宫腔内正常桑葚胚、正常囊胚、异常桑葚胚、异常胚胎Fig.2 Normal morula，normal blastocysts，abnormal morula and abnormal embryos in the uterine cavity of mice in two groups at 3.5 days of pregnancy

图3 A 组小鼠出现阴道流血现象Fig.3 Vaginal bleeding of mice in group A

图4 A 组阴道流血小鼠解剖发现子宫内暗红色积血Fig.4 Dark red hematocele in uterus of vaginal bleeding mice in group A

图6 A 组小鼠子宫腔内发现异常胎盘及暗绿色污物Fig.6 Abnormal placenta and dark green dirt were found in uterine cavity of mice in group A

3 讨论

手术室工作环境中，由于麻醉技术或其他问题比如不适当的面罩、未充盈的气管套囊或喉罩气道袖口充气不足等，都有可能导致手术室存在着低浓度残余吸入麻醉药，造成微量麻醉废气污染环境［12］。流行病学研究资料显示，长期暴露于微量的麻醉废气污染环境的女性工作者，其自然流产、畸胎出生及生育能力下降发生的几率都明显高于不接触吸入麻醉废气的妇女［13］。美国女麻醉师自然流产率达38%，而一般医师为10%。英国、丹麦、芬兰等国家亦发现女性麻醉医师流产率增高［14］。近年来研究发现，长期暴露于超出标准麻醉废气浓度的工作人员可能出现遗传学改变，长期吸入麻醉废气还可增加氧化应激、DNA 损伤［15］、染色体损伤［16］、基因毒性［13］以及肿瘤的发生。还有文献［17］证明孕期接触麻醉废气可能会对胎儿大脑产生负面影响，子代在学龄时期注意力不集中或多动症的发生率增高。

由于各地手术室条件和通风设施不同，故文献报道的各吸入麻醉废气浓度也不一致。在没有麻醉废气处理设备的手术室进行吸入全麻，麻醉医师工作区域七氟烷平均浓度可达0.001 2%［18］。即使在有废气处理设备的层流手术室内，七氟烷浓度也会在某时间段内升高，如在麻醉诱导期，空气中七氟烷浓度可达0.001 7%［19］，且麻醉医师工作区域七氟烷平均浓度高达0.004 6%，其浓度超过国际推荐值［20］。有研究表明，七氟烷可能诱导胚胎发育迟缓［21］、影响幼鼠的学习和记忆功能［22］。鼠类七氟烷MAC 为2.40%～2.50%，与人类相近，根据前期实验研究结果［23］，本研究选取0.1%七氟烷模拟手术室废气环境，小鼠每天吸入6 h，连续吸30 d，大约相当于工作6～7年左右［24］。

胚胎植入前的子宫内膜处于分泌期，子宫内膜发生一系列形态及生理生化的改变，为胚泡着床做准备。母体雌激素和孕激素协同对胚胎的植入过程进行精细调节，子宫内膜对胚胎的接受能力称之为子宫内膜容受性。胚泡着床又称为植入，该过程包括胚泡在子宫内膜中的识别定位、黏附及入侵等，此过程是母体与胚胎相互作用的结果，是妊娠能否成功的关键。在小鼠等啮齿类动物中，着床期发生在受精后4～5 d，大约持续24 h［25］。人类受精后受精卵约3～4 d进入子宫腔中，受精卵在宫腔内游离2～3 d 后，胚泡从透明带中脱出，使表面滋养外胚层暴露在外，此时滋养外胚层向外伸展，对细胞外基质产生了粘附性。同时，围绕在胚泡腔的壁滋养外胚层分化成为初生滋养层，侵入子宫基质层及血管基底膜中；而次生滋养层是由内细胞团相连的滋养外胚层分化成的，其向子宫蜕膜组织侵入，最终侵及至子宫内膜基底层和子宫内1/3的肌层，最终完成了胚胎种植的过程［26-27］。

本研究中，七氟烷组小鼠分别出现了假孕、子宫肿胀且宫腔内未发现胚胎、异常胚胎、阴道流血、异常胎盘等现象；孕18.5 d 解剖得胚胎，七氟烷组胚胎体质量、身长低于正常组胚胎。这些现象均表明长期吸入0.1%七氟烷导致子宫内膜容受性减小，干扰胚胎着床，增加流产几率，影响受精卵向桑葚胚及囊胚的转变，减缓胚胎的发育，影响雌性小鼠生殖功能。本研究模拟长期暴露于七氟烷麻醉废气环境，选取了0.1%七氟烷进行结果观察，但吸入低于0.1%浓度的七氟烷是否也具有该影响未进行研究，且对其发生机制仍不清楚，仍需大量实验进行下一步关于影响机制的研究，来证明长期暴露于七氟烷对手术室女性工作人员有无生殖功能的影响。