哮喘小鼠CCR4/TARC信号轴对Treg/Th17细胞平衡的调控研究

刘彤 银维谋 蓝娇 龙胜泽 覃松梅 韦彩周 韦碧妙李凤献 罗凌 覃雪军

1广西壮族自治区人民医院呼吸与危重症医学科（南宁530021）；2广西柳州市人民医院呼吸与危重症医学科（广西柳州545006）

支气管哮喘是一种病因复杂的慢性非特异性炎症。淋巴细胞介导的免疫失衡在支气管哮喘的发病中担任着重要角色。既往研究提示，支气管哮喘发病除了受辅助性T 细胞1（T helper cell 1，Th1）/辅助性T 细胞2（T helper cell 2，Th2）失衡影响外，还与调节性T 淋巴细胞（regulatory T cells，Treg）/辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）细胞的失衡有关［1-2］。但是，目前对于Treg/Th17细胞免疫失衡在哮喘中的作用机制尚不明确。CCR4/TARC信号轴在肿瘤细胞转移、胸腔积液患者Foxp3+Treg向胸腔募集等均起到调控作用［3］。而Treg 和Th17表面 均 存在CCR4 表 达，TARC 又 是CCR4 的特 异性配体之一［4］。在支气管哮喘中，CCR4/TARC 信号轴是否参与了Treg/Th17 细胞平衡的调控对于加深对支气管哮喘发病机制的了解有着重要意义。为了进一步明确CCR4/TARC 信号轴、Treg/Th17 细胞平衡与支气管哮喘炎症之间关联，本研究通过建立哮喘小鼠模型对此进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择广西医科大学动物实验中心的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级BALB/C 雌性小鼠20 只作为研究对象。纳入标准：所有小鼠均被饲养在SPF 级实验小鼠实验室，其喂养饲料均接受过无菌处理，且饲料成分中不含卵清蛋白（ovablumin，OVA）。按简单随机分组法，20 只雌性BALB/C 小鼠分为哮喘组10 只（1 只小鼠因出现呼吸抑制死亡）和对照组（10 只），分笼饲养。两组小鼠的周龄均为6～7 周，体重18～22 g，比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠致敏于实验开始的第0 天、第7 天及第14 天分别进行3 次致敏，方法如下：给每只哮喘组小鼠进行局部皮肤碘伏消毒，然后腹腔注射OVA 致敏混悬液0.2 mL，其中包含有OVA 25 μg 和氢氧化铝凝胶0.1 mL。对照组小鼠则注射同等剂量的1×PBS。

1.2.2 小鼠激发从实验第21 天开始进行小鼠激发，每天1 次，连续7 d。方法如下：首先应用碘伏对哮喘组小鼠进行局部皮肤消毒，然后自腹腔向小鼠注射1%戊巴比妥钠混合液完成麻醉，注射剂量为45 mg/kg，再用OVA 溶液40 μL 进行滴鼻。对照组则进行同等量1×PBS 滴鼻。

1.2.3 样本采集两组小鼠均在最后1 次激发后处死，然后采集小鼠外周血、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），进行离心分离进行ELISA 检测，并分离肺组织，提取淋巴细胞进行测定。

1.3 观察指标（1）比较两组小鼠肺组织病理学改变。（2）比较两组小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴细胞的占比、CCR4 在Treg 和Th17 中的表达水平。（3）比较两组小鼠BALF 中白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）和TARC 浓度。（4）分析肺组织炎症评分与BALF 中TARC 的相关性及哮喘组肺内Th17 细胞的比例变化与BALF 中TARC 浓度的相关性。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0 进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示，采用F检验，计数资料采用Mann-WhitneyU检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变 哮喘组小鼠支气管黏膜、基底膜、肺间质和肺泡壁均增厚，部分肺泡结构破坏，支气管及血管周围出现明显炎性细胞浸润，对照组无此改变。

2.2 两组小鼠支气管及其周围炎症细胞浸润评分比较哮喘组炎症细胞浸润评分显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组小鼠支气管及其周围炎症细胞浸润评分比较Tab.1 Comparison of inflammatory cell infiltration scores in bronchus and surrounding areas between the two groups 例（%）

2.3 两组小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴细胞的占比比较哮喘组小鼠肺内、外周血中的Treg 细胞在CD4+T 淋巴细胞占比低于对照组，哮喘组小鼠肺内、外周血Th17 细胞在CD4+T 淋巴细胞的在高于对照组，哮喘组肺内、外周血中的Treg/Th17细胞比值显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、3。

表2 肺组织淋巴细胞Treg、Thl7 百分比检测结果Tab.2 Detection results of Treg and Thl7 percentages of lymphocytes in lung tissue ±s

表2 肺组织淋巴细胞Treg、Thl7 百分比检测结果Tab.2 Detection results of Treg and Thl7 percentages of lymphocytes in lung tissue ±s

组别哮喘组对照组t 值P 值例数9 10 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞（%）4.54±2.68 11.54±1.8 1.550＜0.001 CD4+IL-17+T 细胞（%）2.58±0.43 0.76±0.15 7.873＜0.001 Treg/th17 细胞1.88±1.31 15.35±2.30 4.178＜0.001

表3 外周血淋巴细胞Treg、Thl7 百分比检测结果Tab.3 Detection results of Treg and Thl7 percentages of peripheral blood lymphocytes ±s

表3 外周血淋巴细胞Treg、Thl7 百分比检测结果Tab.3 Detection results of Treg and Thl7 percentages of peripheral blood lymphocytes ±s

组别哮喘组对照组t 值P 值例数9 10 CD4+CD25+Foxp3+ T 细胞（%）3.73±0.58 10.05±2.43 2.294＜0.001 CD4+IL-17+T 细胞（%）2.12±0.69 0.93±0.41 3.009 0.001 Treg/th17 细胞1.95±1.34 13.43±7.65 14.530＜0.001

2.4 两组小鼠CCR4 在Treg 细胞和Th17 细胞中的表达比较哮喘组肺内、外周血中的CCR4 在Treg、Th17 细胞中的表达与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 CCR4 表达Fig.1 Expression results of CCR4

2.5 两组小鼠血清和BALF 中IL-17A和TARC 浓度比较两组小鼠IL-17A 在血清和BALF 中的浓度均呈低水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组小鼠血清中TARC 的浓度均呈低水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；哮喘组小鼠BALF 中TARC 的浓度高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4、5。

表4 两组小鼠血清中和BALF 中IL-17A 的浓度Tab.4 Concentrations of IL-17A in serum and BALF of mice in two groups ±s

表4 两组小鼠血清中和BALF 中IL-17A 的浓度Tab.4 Concentrations of IL-17A in serum and BALF of mice in two groups ±s

组别哮喘组对照组t 值P 值例数9 10血清中IL-17A的浓度（pg/mL）7.19±0.01 7.20±0.03 0.994 0.796 BALF 中IL-17A的浓度（pg/mL）7.46±0.43 7.24±0.07 1.516 0.934

表5 两组小鼠血清中和BALF 中TARC 的浓度Tab.5 Concentration of TARC in serum and BALF of two groups of mice ±s

表5 两组小鼠血清中和BALF 中TARC 的浓度Tab.5 Concentration of TARC in serum and BALF of two groups of mice ±s

组别哮喘组对照组t 值P 值例数9 10血清中TARC的浓度（pg/mL）21.96±6.44 22.15±4.54 0.073 0.713 BALF 中TARC的浓度（pg/mL）108.27±62.16 41.07±18.95 2.137 0.006

2.6 哮喘组肺内炎症细胞浸润评分与BALF 内TARC 浓度的相关性哮喘组肺内炎症细胞浸润评分与BALF 内TARC 浓度呈正相关（r=0.673，P＜0.05）。

2.7 哮喘组肺内Th17细胞与BALF内TARC浓度的相关性分析哮喘组肺内Th17 细胞与BALF 内TARC 浓度呈正相关（r=0.586，P＜0.05）。

3 讨论

既往研究认为，支气管哮喘的发病主要是因Th1/Th2细胞比例失衡所致［5-6］。近年来的研究发现，Treg 数目变化或功能缺陷与支气管哮喘气道炎症有关，而Treg 细胞与Th17 细胞的关系密切［7-9］。Th17/Treg 细胞比例失衡与哮喘的炎症反应的相关性已被研究证实，但其具体作用机制以及受何种因素影响尚不清楚。明确Treg/Th17 细胞失衡的作用机制以及其所受调控因素对支气管哮喘的诊疗有着重要意义。

Treg 特异性表达CD25 及其转录因子Foxp3 能够介导机体免疫功能，抑制CD4+CD25-T 淋巴细胞的表达，还能对Th1 与Th2 细胞产生抑制作用，影响T 淋巴细胞的分化。既往动物实验显示，Treg能够通过介导Th2 细胞减轻气道对过敏原的反应，进而缓解哮喘气道炎症［10-11］。Th17细胞会产生IL-17A 等细胞因子，而其分化又受到TGF-β、IL-6、IL-23 等因子调节。TGF-β和视黄酸呈高表达会促进Treg 的分化，TGF-β、IL-6 及IL-1β呈低表达则会对Th17 的分化起到促进作用［12］。由此可知，Treg与Th17 细胞在功能方面具有拮抗作用，通常情况下二者保持着一定的平衡，维持着机体功能正常作用。但一旦这种平衡被破坏，则会导致机体免疫受损，引发免疫相关疾病［13-14］。本研究通过流式细胞术对哮喘小鼠模型肺内和外周血中的Treg、Th17 细胞在CD4+T 淋巴细胞中所占比例进行检测发现：哮喘小鼠的Treg 无论是在肺内还是在外周血中的浓度比无哮喘小鼠均更低，而肺内和外周血的Th17 细胞浓度较无哮喘小鼠则明显更高；哮喘小鼠在肺内和外周血中的Treg/Th17 细胞比值与无哮喘小鼠比较则出现明显下降。在机体自身状态稳定、无损伤时，免疫系统的TGF-β始终处于低水平。少量的TGF-β可诱导初始T 细胞分化出Treg 细胞，Treg/Th17 细胞比值处于平衡状态。TGF-β水平较低时，其分化作用也相对较弱。但在机体有炎症损伤的情况下，免疫系统则释放出大量TGF-β、IL-6 等细胞因子，导致Th17 细胞分化作用大幅增强，导致Th17 浓度上升，打破Treg和Th17 平衡，引发Treg/Th17 细胞比值变化。由此可见，哮喘气道炎症与Treg/Th17 细胞比值在肺内和外周血中的失衡有密切关联，与既往研究一致［11-13］。

Treg 和Th17 表面都存在CCR4 表达，TARC 又是CCR4 的特异性配体。已有研究表明，处于急性期的哮喘儿童TARC 水平异常升高［15-17］。因此推测CCR4/TARC信号轴也可能对Treg与Th17 之间平衡产生影响，进而影响炎症发展。已有多项研究明确了CCR4/TARC 信号轴可在多种疾病中发挥调控作用，如Foxp3+Treg 向胸腔募集、肿瘤细胞转移等［18-20］。因此，CCR4/TARC 信号轴也可能通过调控Treg/Th17 细胞平衡而促进炎症向肺内的浸润。本研究中，Treg 和Th17 细胞在哮喘组和正常小鼠的CCR4 中的表达水平均较高，且二者之间差异无统计学意义，由此提示CCR4/TARC 信号轴可对Treg 和Th17 细胞发挥调控作用，且调控效能无差异。IL-17A 在Th17 细胞中发挥着主要作用［21］。但本研究发现，哮喘小鼠和正常小鼠IL-17A 在血清和BALF 中均呈低水平，且比较差异无统计学意义。对此，推测原因可能是因为Th17 细胞比例虽增加但并未被激活，因此未起到介导炎症的作用。而且Th17 在急性哮喘中并非通过IL-17A 介导炎症反应，而是以IL-17F、IL-22 为主［22］。通过TARC的浓度检测发现，两组小鼠血清中TARC 呈低水平，而在哮喘组BALF 中TARC 的浓度要高于正常小鼠，且两组小鼠TARC 在BALF 内的水平较血清中明显更高。分析认为，这可能是因为小鼠气道上皮细胞产生的TARC 导致了其在BALF内的水平上升，也可能是气道内其他炎症细胞产生的TARC 导致了其水平升高。通过相关性分析发现，肺组织肺内炎症细胞浸润评分越高，BALF内TARC浓度也越高，二者呈正相关；而且哮喘组肺内Th17细胞的比例变化与BALF 内TARC 的浓度变化呈正相关。由此得出，哮喘小鼠CCR4/TARC 信号轴通过调控Th17 细胞向肺组织的浸润。

综上所述，Treg/Th17 细胞比值变化与哮喘肺内炎症的发生、发展有密切相关，而CCR4/TARC信号轴可能通过对Th17 的调控参与炎症向肺内的浸润。