miR-149通过BMP/Smad信号通路对舌鳞状细胞癌细胞增殖侵袭的影响

李京洋 保森竹 姚毅章 黄文泉

1青海省第五人民医院/青海省肿瘤医院（西宁810000）；2青海大学附属医院（西宁810000）；3江西中医药大学附属医院（南昌330006）

舌鳞状细胞癌（TSCC）是一种以上皮来源为主的中分化鳞癌或高分化鳞癌，是最常见的口腔恶性肿瘤［1］。TSCC 的临床表现主要为语音、咀嚼和吞咽方面的功能障碍，疾病后期往往发生局部或区域性复发和颈部淋巴结转移［2］。针对TSCC，目前尚无特效治疗方法，主要以单纯手术治疗、放射治疗、全身化疗和靶向治疗为主要方向［3-4］。miR-149 以其广泛参与生物学调控、在各种肿瘤中表达均异常等特点已然成为现代医学研究的新方向和新思路。但是目前关于miR-149 的报道主要集中在膀胱癌、食管癌和骨肉瘤细胞等方面，对于miR-149 对舌鳞状细胞癌细胞的影响和机制方面缺乏系统报道［5-8］。本研究旨在探讨miR-149通过BMP/Smad 信号通路对TSCC 细胞增殖侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 研究材料人舌鳞癌细胞Tca8113（Procell，CL-0230）、人舌鳞癌细胞CAL-27（Procell，CL-0265）。

1.2 主要仪器和试剂miR-149 qRT-PCR 试剂盒（TransScript，AQ202-01）、细胞增殖检测试剂盒（联科生物，CP001）、BMP-2 抗体（BioVision，5672-100）、Anti-SMAD1/3/5 抗体（abcam，ab118825）、Anti-SMAD1/5/8/9 抗体（子起生物，PA141079）、细胞培养箱（力康）、PCR 仪（Thermo）等。

1.3 实验方法采用荧光定量PCR 实验测定miR-149 在舌鳞状细胞癌细胞（Tca8113 和CAL-27）中的mRNA 表达，miR-149 的引物设计如表1所示［9］。采用瞬时转染法将质粒在细胞融合度达到75%时转入Tca8113 和CAL-27 细胞，分别分为miR-149-con 组和miR-149-mim 组（20 pmol Con-mimic/miR-149-mimic 质粒+Lipofectamine 1 μL）［10］，采用MTT法检测miR-149 过表达对Tca8113 和CAL-27 细胞增殖的影响；采用Transwell 细胞侵袭实验检测miR-149 过表达对Tca8113 和CAL-27 细胞侵袭的影响；采用Western blot 检测BMP/Smad 信号通路相关蛋白表达量。

表1 miR-149 引物设计Tab.1 miR-149 primer design

1.4 统计学方法采用t检验分析两组间差异，P＜0.05 为差异有统计学意义，数据均用SPSS 22.0进行统计分析。

2 结果

2.1 miR-149在舌鳞状细胞癌细胞的表达情况由图1可知，CAL-27 和Tac8113细胞中的miR-149 mRNA表达水平相较ATCC细胞显著下调（t=3.562、3.642，P＜0.05）；CAL-27 和Tac8113 细胞中miR-149-mim 组的miR-149 mRNA 表达水平相较miR-149-con 组显著下调（t=9.535、9.672，P＜0.01）。

2.2 miR-149对舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响由图2可知，miR-149-con组和miR-149-mim组CAL-27细胞增殖速度分别为（101.13±24.22）%、（75.41±14.56）%，故miR-149-mim 组CAL-27 细胞增殖速度相较miR-149-con 组显著下调（t=3.322，P＜0.05）；miR-149-con组和miR-149-mim组Tac8113细胞增殖速度分别为（101.83±27.16）%、（73.25±16.25）%，故miR-149-mim 组Tac8113 细胞增殖速度相较miR-149-con 组显著下调（t=3.354，P＜0.05）。

图1 miR-149 在舌鳞状细胞癌细胞的表达情况Fig.1 Expression of miR-149 in tongue squamous cell carcinoma

图2 miR-149 对舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响Fig.2 Effect of miR-149 on the proliferation of tongue squamous cell carcinoma cells

2.3 miR-149 对舌鳞状细胞癌细胞侵袭的影响由图3可知，miR-149-con 组和miR-149-mim 组CAL-27侵袭细胞个数分别为（71.58±7.36）、（19.23±3.82），故miR-149-mim 组的CAL-27 细胞侵袭个数相较miR-149-con 组显著下调（t=3.884，P＜0.05）；miR-149-con 组和miR-149-mim 组Tac8113 细胞侵袭个数分别为（77.49±9.11）、（24.15±3.89），故miR-149-mim 组Tac8113 细胞侵袭个数相较miR-149-con 组显著下调（t=3.892，P＜0.05）。

图3 miR-149 对舌鳞状细胞癌细胞侵袭的影响Fig.3 Effect of miR-149 on the invasion of tongue squamous cell carcinoma

2.4 BMP/Smad 信号通路相关蛋白表达水平由图4可知，miR-149-mim 组的CAL-27 细胞BMP-2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8 表达水平相较miR-149-con组显著下调（t=3.225、3.188、3.354，P＜0.05）。miR-149-mim 组的TAC8113 细胞BMP-2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8 表达水平相较miR-149-con 组显著下调（t=3.243、3.196、3.368，P＜0.05）。

图4 BMP/Smad 信号通路相关蛋白表达水平Fig.4 Expression level of proteins related to BMP/Smad signal pathway

3 讨论

本研究以Tca8113 和CAL-27 作为考查对象，分别分为miR-149-con 组和miR-149-mim 组，研究miR-149通过BMP/Smad信号通路对舌鳞状细胞癌细胞增殖侵袭的影响。荧光定量PCR 实验测定结果发现CAL-27 细胞中的miR-149 mRNA 表达水平相较ATCC 细胞显著下调（P＜0.05）；Tac8113 细胞中的miR-149 mRNA 表达水平相较ATCC 细胞显著下调（P＜0.05）；miR-149-mim 组CAL-27 细胞miR-149 mRNA 表达水平相较miR-149-con 组显著下调（P＜0.01）；miR-149-mim 组Tac8113 细胞miR-149 mRNA 表达水平相较miR-149-con 组显著下调（P＜0.01）。MTT 法检测结果发现miR-149-mim 组CAL-27细胞增殖速度相较miR-149-con组显著下调（P＜0.05）；miR-149-mim 组Tac8113 细胞增殖速度相较miR-149-con组显著下调（P＜0.05）。Transwell细胞侵袭实验检测结果发现miR-149-mim 组的CAL-27细胞侵袭个数相较miR-149-con组显著下调（P＜0.05）；miR-149-mim 组Tac8113 细胞侵袭个数相较miR-149-con 组显著下调（P＜0.05）。Western blot 检测结果发现miR-149-mim 组的CAL-27 细胞BMP-2 表达水平、Smad1/5/8 表达水平和p-Smad1/5/8表达水平相较miR-149-con组显著下调（P＜0.05）；miR-149-mim 组的TAC8113 细胞BMP-2、Smad1/5/8和p-Smad1/5/8 表达水平相较miR-149-con 组显著下调（P＜0.05），说明miR-249 对Tca8113 和CAL-27 增殖和侵袭的影响与激活BMP/Smad 信号通路有关。

TSCC 恶性程度高，生长快，浸润性强，且早期易发生淋巴结转移［11］。CHEN 等［12］研究异嗜性和多性逆转录病毒受体1（XPR1）发现，与正常舌头组织相比，TSCC 组织中的XPR1 明显上调。XPR1的高表达与TSCC的恶性特征和较差的患者存活率显著相关。XPR1 的异位表达增加，而XPR1 的沉默则降低TSCC 细胞的增殖、侵袭和抗凋亡能力。YANG 等［13］研究发现神经周浸润（PNI）是TSCC、口腔癌的不良预后因素。在控制T 期和病理分化后，PNI 仍然是宫颈淋巴结转移（CLNM）、局部复发、颈部复发和疾病特异性生存（DSS）的独立预测因子。END 也不能改善PNI 患者的颈部控制或DSS。REN 等［14］研究发现TSCC 细胞系和组织中长非编码RNA 在大肠癌的差异表达（CRNDE）上调。CRNDE 的过表达增加了TSCC 细胞增殖、细胞周期和细胞侵袭。此外，CRNDE 的异位表达抑制了SCC1 细胞中miR-384 的表达，并增加了Kirsten Ras（KRAS），细胞分裂周期42 和胰岛素受体底物1的表达，这是miR-384 的直接靶基因。与配对的相邻非肿瘤样品相比，TSCC 样品中的miR-384 表达下调。SHI 等［15-17］研究发现TSCC 组织和细胞系中miR-488 的水平显著降低，而ATF3 的表达显著提高。引入miR-488 可以显著抑制TSCC 细胞的侵袭和上皮-间质转化（EMT），而敲低miR-488 则可以促进这两个过程。ATF3 是miR-488 的潜在靶基因且miR-488 可以直接靶向ATF3。ATF3 沉默与miR-488 在TSCC 细胞上的过表达具有相似的作用。TSCC 细胞中ATF3 的过度表达部分逆转了miR-488 模拟物的抑制作用。miR-488通过直接下调ATF3表达来抑制TSCC细胞的侵袭和EMT。

综上所述，本研究结果显示过表达miR-149可以通过激活BMP/Smad 信号通路实现对TSCC细胞增殖侵袭的抑制作用。研究尚存在不足之处：本研究并未对miR-149 调控BMP/Smad 信号通路介导TSCC 细胞生物学行为变化过程中涉及的具体细胞因子、靶基因以及机制进行具体分析，此外miR-149 对TSCC 细胞周期的影响仍需要进行后续试验的深入研究。